衛(wèi) 春，許 珂，張莉蕓

(1.山西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，太原 030001； 2.山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院 山西大醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，太原 030032)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA) 的發(fā)病機(jī)制主要包括免疫紊亂、組織細(xì)胞損傷及骨破壞。其發(fā)病率及致畸、致殘率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，已成為全球健康保健的重要問(wèn)題之一。目前，RA的治療主要以緩解癥狀、減少并發(fā)癥為主，但其臨床緩解率僅達(dá)50%左右[1]。大量基礎(chǔ)研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可有效改善RA動(dòng)物模型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度，抑制免疫細(xì)胞及炎癥細(xì)胞因子，促進(jìn)組織修復(fù)[2-6]。但MSCs來(lái)源有限，且靜脈輸注可致心律失常、體內(nèi)異位成骨、成瘤等潛在風(fēng)險(xiǎn)限制了其臨床應(yīng)用。而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)可介導(dǎo)細(xì)胞間的信號(hào)傳達(dá)，釋放生物活性物質(zhì)、信使RNAs、微RNAs(microRNAs，miRNAs)等。EVs依據(jù)細(xì)胞來(lái)源不同發(fā)揮各種功能，且通過(guò)不同機(jī)制與受體細(xì)胞相互作用，如與靶細(xì)胞質(zhì)膜融合，或通過(guò)內(nèi)吞作用內(nèi)化，或與細(xì)胞表面受體相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等[7-9]。由于間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells，MSC-EVs)可模擬其母體細(xì)胞發(fā)揮治療作用，且可規(guī)避細(xì)胞療法的潛在風(fēng)險(xiǎn)，故MSCs-EVs逐漸成為研究熱點(diǎn)。現(xiàn)就MSCs及MSCs-EVs在RA中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 MSCs特性

MSCs是來(lái)自骨髓、脂肪、牙髓和臍帶等各種組織的成熟干細(xì)胞，其中具有治療作用的主要來(lái)源于骨髓和脂肪組織，其可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞[10]。此外，MSCs還可通過(guò)分泌生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子等多種營(yíng)養(yǎng)因子，發(fā)揮抗炎、促增殖、抗凋亡、抗纖維化、促血管生成作用[7]。

MSCs的分化潛能和旁分泌功能，使其與骨軟骨缺損、骨關(guān)節(jié)病的軟骨修復(fù)和組織重建密切相關(guān)。MSCs在特定培養(yǎng)基條件下分化為軟骨細(xì)胞，并產(chǎn)生分泌軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分化細(xì)胞，分化的軟骨細(xì)胞性能接近原始透明軟骨。為獲得更多功能成熟的軟骨細(xì)胞，在臨床前動(dòng)物模型中，Vinatier等[11]研制出多種方法將MSCs與仿生支架和生長(zhǎng)因子相結(jié)合，以支持軟骨細(xì)胞分化，形成功能性透明關(guān)節(jié)軟骨。

MSCs的抗纖維化作用被證明是通過(guò)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和腎上腺髓質(zhì)的產(chǎn)生來(lái)介導(dǎo)[12]。在損傷組織中，MSCs通過(guò)產(chǎn)生抗氧化分子發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，如血紅素加氧酶1和促紅細(xì)胞生成素[13]。當(dāng)暴露于炎癥環(huán)境時(shí)，MSCs可以發(fā)揮抗炎作用，即腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β或IL-1α等炎癥因子激活MSCs，使其獲得免疫抑制特性，調(diào)節(jié)固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖、分化，誘導(dǎo)CD4+CD25+叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg細(xì)胞)產(chǎn)生[14]。此外，MSCs還可通過(guò)抑制Toll樣受體的活化和誘導(dǎo)耐受性IL-10的產(chǎn)生，抑制樹(shù)突狀細(xì)胞活化和成熟，并通過(guò)誘導(dǎo)炎癥M1型向M2型巨噬細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)化，抑制自然殺傷細(xì)胞活化[15]。這些免疫抑制功能由接觸依賴(lài)性機(jī)制介導(dǎo)，主要調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的釋放，如吲哚胺2，3-雙加氧酶、一氧化氮、IL-6、前列腺素E2、腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子誘導(dǎo)基因6、人類(lèi)白細(xì)胞抗原G5、IL-1受體拮抗劑等[16]?？梢?jiàn)，MSCs通過(guò)分泌和旁分泌機(jī)制產(chǎn)生大量介質(zhì)，在風(fēng)濕性疾病，尤其是RA患者的治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

2 MSCs與RA

RA是一種慢性自身免疫性疾病，以滑膜炎癥為特征，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨漸進(jìn)性破壞。其發(fā)病率高，致殘性強(qiáng)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，免疫細(xì)胞在RA的發(fā)生發(fā)展中起核心作用，且針對(duì)免疫細(xì)胞為治療靶點(diǎn)的生物制劑在一定程度上提高了RA的臨床緩解率，特別是對(duì)難治性RA患者，但約30%的患者仍無(wú)效[17]。此外，生物制劑價(jià)格昂貴，存在誘發(fā)腫瘤、結(jié)核等感染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，且停藥后病情容易復(fù)發(fā)。

目前RA的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，研究多集中在炎癥通路、趨化因子通路及骨破壞通路，其中炎癥通路在RA中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th細(xì)胞)1和Th17細(xì)胞是導(dǎo)致RA發(fā)病的核心T亞群[18]。在RA患者中，由Th1細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子-α、IL-1、IL-2、γ干擾素及Th17細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17、IL-6等炎癥因子水平升高；而Th2細(xì)胞、Treg細(xì)胞產(chǎn)生的抗炎因子(IL-4、IL-10、IL-35和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β等)水平降低[19]。因此，Th1/Th2及Th17/Treg的失衡與RA的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而IL-1、腫瘤壞死因子-α被認(rèn)為是RA發(fā)病的重要促炎細(xì)胞因子，IL-10、腫瘤壞死因子-β為重要的抗炎細(xì)胞因子。B細(xì)胞可以分泌包含類(lèi)風(fēng)濕因子在內(nèi)的各種自身抗體，在RA的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)，骨髓、脂肪、滑膜、臍帶等來(lái)源的異基因MSCs移植對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠具有治療作用[20]。針對(duì)RA動(dòng)物模型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓來(lái)源的MSCs移植不僅可改善膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)癥狀、影像學(xué)及病理表現(xiàn)，還可抑制T、B細(xì)胞增殖，上調(diào)Treg細(xì)胞、下調(diào)Th17細(xì)胞水平，抑制促炎因子(腫瘤壞死因子-α、IL-1、IL-17)的表達(dá)[3-5]。因此，MSCs在炎癥性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮抗炎作用，其可能成為治療RA的新細(xì)胞治療方案。但MSCs在體內(nèi)有導(dǎo)致毛細(xì)血管阻塞、異位成骨等潛在風(fēng)險(xiǎn)，故使其臨床應(yīng)用受限。且有研究顯示，MSCs治療RA無(wú)明顯改善，這可能與動(dòng)物遺傳背景有關(guān)，也可能與永生化小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有關(guān)[21]。

3 MSC-EVs與RA

3.1EVs EVs是磷脂雙分子層包繞形成的異質(zhì)性膜分泌體，幾乎所有類(lèi)型的細(xì)胞均可分泌，其存在于各種生物體液(血液、尿、唾液、腦脊液、母乳和其他)中。依據(jù)大小、組成和來(lái)源不同，EVs可分為外泌體、微粒(或泡)和凋亡小體[22]。其中，外泌體是由多微囊泡內(nèi)體與細(xì)胞質(zhì)膜融合釋放的EVs，其直徑為40～100 nm。微粒也叫微囊泡，是細(xì)胞受刺激或應(yīng)激(缺氧誘導(dǎo))產(chǎn)生的EVs，當(dāng)磷脂不對(duì)稱(chēng)分布或細(xì)胞骨架重組后微囊泡直接從細(xì)胞質(zhì)膜脫落，直徑為100～1 000 nm，其表達(dá)親代細(xì)胞膜表面受體。凋亡小體是EVs的第三種主要類(lèi)型，直徑>1 000 nm，誘導(dǎo)晚期細(xì)胞死亡的小泡。在病理情況下，微囊泡可能有致病作用，并促進(jìn)疾病的進(jìn)展，反過(guò)來(lái)其也可能保護(hù)和防止疾病的發(fā)展。 與其他細(xì)胞類(lèi)型類(lèi)似，MSC-EVs可通過(guò)傳遞信息與其他細(xì)胞相互作用來(lái)模擬其母體細(xì)胞的作用，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)組織修復(fù)及再生作用[23-25]。

3.2MSC-EVs在RA中的免疫調(diào)節(jié)作用 在RA、骨關(guān)節(jié)炎、自身免疫性腦脊髓炎等炎癥疾病中，MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用備受關(guān)注。雖然MSC-EVs在RA臨床前模型中的治療效果報(bào)道較少，但一些體外研究已證實(shí)了MSC-EVs的免疫調(diào)節(jié)作用[23,26-27]。MSC-EVs治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的研究顯示，MSC-EVs具有免疫抑制作用，其可以減少 T細(xì)胞的增殖，增加IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；同時(shí)，MSC-EVs也可促進(jìn)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，半乳凝素1和膜結(jié)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的表達(dá)，這些均是參與免疫耐受的關(guān)鍵分子[23]。另有研究證明了MSC-EVs對(duì)T亞群的免疫調(diào)節(jié)作用，當(dāng)人臍帶MSCs來(lái)源的EVs與活化的脾臟組織勻漿共培養(yǎng)時(shí)，Th17細(xì)胞數(shù)量減少、IL-17 水平降低，叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3+Treg細(xì)胞數(shù)量增加[26]。Blazquez等[27]研究證實(shí)，與MSC-EVs共培養(yǎng)的T細(xì)胞，其活化和分化被阻止，這與CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的γ干擾素減少有關(guān)。此外，MSC-EVs也可以減少B細(xì)胞增殖和分化，使免疫球蛋白的分泌減少[28]。然而有學(xué)者指出，MSC-EVs產(chǎn)生的免疫抑制效果較MSCs弱，且隨著MSC-EVs水平降低，其對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用減弱[29]?？梢?jiàn)，MSCs和MSC-EVs均可以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，且MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用部分是由EVs釋放調(diào)控分子介導(dǎo)。

3.3MSC-EVs在RA中的再生作用 MSC-EVs具有再生作用，包括促血管生成、抗凋亡、抗纖維化、促增殖，其已在一些動(dòng)物模型中進(jìn)行研究，包括心肌梗死、腦梗死和急性腎損傷等[30]。關(guān)于MSC-EVs的促血管生成活性，有研究表明，其可通過(guò)促血管生成效應(yīng)保護(hù)缺血再灌注損傷的腎損傷[24]?；诰珳?zhǔn)分辨率的等電聚焦耦合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的蛋白組學(xué)分析顯示，MSC-EVs不僅包含生長(zhǎng)因子，如表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子等，還含有核因子κB信號(hào)通路，這些均可促進(jìn)血管的生成[31]。MSC-EVs中的蛋白質(zhì)因子與靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞膜相互作用，通過(guò)細(xì)胞融合延遲信使RNAs的傳遞，最終誘導(dǎo)形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)[32]。

MSC-EVs的增殖效應(yīng)在不同的模型，特別是皮膚修復(fù)中被研究。在皮膚損傷修復(fù)過(guò)程中，MSC-EVs 能被成纖維細(xì)胞吸收并內(nèi)化，以促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖和膠原產(chǎn)生[33]。且四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷可通過(guò)MSC-EVs分泌的增殖細(xì)胞核抗原增加，促使肝細(xì)胞增殖[25]。在急性心肌梗死大鼠模型中，MSC-EVs干預(yù)后心臟功能得到明顯改善[34]。這是因?yàn)镸SC-EVs可加速內(nèi)皮細(xì)胞生成和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)血管形成。

MSC-EVs不僅具有促增殖作用，還有明顯的抗凋亡能力。如當(dāng)骨肉瘤細(xì)胞與MSC-EVs共培養(yǎng)時(shí)，MSC-EVs通過(guò)運(yùn)輸轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表現(xiàn)出明顯抗凋亡作用，包括單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、骨形態(tài)生成蛋白2、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7、基質(zhì)金屬蛋白酶-1和黏著斑激酶1[35]。另一項(xiàng)對(duì)順鉑干預(yù)的人腎小管上皮細(xì)胞凋亡體外模型進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs 可上調(diào)抗凋亡基因，如B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-xL、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2和人桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)序列8，抑制可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因，如胱天蛋白酶(caspase)1、caspase-8和淋巴毒素α[36]。在結(jié)腸炎中，MSC-EVs通過(guò)減少caspase-3、caspase-8和caspase-9的裂解抑制細(xì)胞凋亡[37]。在單側(cè)輸尿管梗阻腎損傷中，MSC- EVs通過(guò)調(diào)節(jié)miRNAs表達(dá)，包括miR-299、miR-499、miR-302和miR-200c，發(fā)揮重要的抗凋亡作用[37]。MSC-EVs通過(guò)在體內(nèi)外下調(diào)凋亡信號(hào)增加腎臟細(xì)胞的生存概率。

Li等[38]的研究表明，MSC-EVs具有抗纖維化作用。MSC-EVs可通過(guò)減少肝臟組織中的膠原沉積，肝臟中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的表達(dá)，及肝纖維化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中白細(xì)胞抑制因子2的磷酸化減輕四氯化碳干預(yù)的肝纖維化肝炎。同樣，在甘油或順鉑引起的腎損傷中，MSC-EVs可減輕腎纖維化，恢復(fù)腎功能[39]。在這些模型中，MSC-EVs 改善了氧化應(yīng)激和減少細(xì)胞凋亡，最終增加細(xì)胞增殖。

MSC-EVs具有與親代MSCs類(lèi)似的再生、抗凋亡、抗纖維化和抗炎功能，為其母體細(xì)胞在治療RA方面的應(yīng)用提供了新視角。但關(guān)于MSC-EVs治療RA國(guó)內(nèi)外研究較少。Zhang等[40]的研究證明，在免疫功能低下的大鼠骨軟骨缺損模型中，MSC-EVs 可促進(jìn)軟骨再生，且注射EVs可加速組織填充、Ⅱ型膠原基質(zhì)的合成和增強(qiáng)黏多糖硫酸化，12周后，經(jīng)MSC-EVs干預(yù)的大鼠軟骨和軟骨下骨完全愈合[40]。該研究證明了MSC-EVs在體內(nèi)促進(jìn)軟骨修復(fù)的有效性。

4 小 結(jié)

EVs維持著細(xì)胞之間的通訊，并在組織再生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。但目前對(duì)EVs信使作用的認(rèn)知仍處于初始階段。此外，不同類(lèi)型的EVs的具體作用尚未明確，影響外泌體或微泡合成和釋放的因素尚未確定。但EVs在風(fēng)濕性疾病病理生理學(xué)中的重要作用，及其作為RA生物標(biāo)志物的可能性值得進(jìn)一步研究。同時(shí)，不同細(xì)胞分離的EVs治療的有效性需要在不同的臨床前模型中被評(píng)估。雖然MSC-EVs已被證明可能有助于MSCs更好地發(fā)揮治療作用，其可能是RA治療的新手段之一，但對(duì)于MSC-EVs在風(fēng)濕性疾病的治療仍研究較少，未來(lái)需進(jìn)一步探討。