蔣瀚佶，封 波

(北京大學(xué)人民醫(yī)院 北京大學(xué)肝病研究所 丙型肝炎和肝病免疫治療北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100044)

慢性丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染是導(dǎo)致肝硬化、肝癌的重要原因之一。全球范圍內(nèi)約有71 000 000例HCV感染患者[1]。應(yīng)用直接抗病毒藥物(direct-acting antiviral agents，DAAs)治療慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)患者具有較高(>95%)的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virological response，SVR)率以及較低的毒性，現(xiàn)已成為國際公認(rèn)的CHC治療的一線藥物[2]。自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞在人類肝臟(30%)及外周血(5%～20%)淋巴細(xì)胞中均大量存在，并在病毒性肝炎中顯著增加[3]。NK細(xì)胞在抗病毒免疫應(yīng)答中起重要作用，在慢性病毒感染中NK細(xì)胞的亞群分布、表型以及功能學(xué)指標(biāo)發(fā)生顯著改變[4]。與傳統(tǒng)的α干擾素/利巴韋林治療方案相比，DAAs通過抑制HCV的NS3蛋白酶、NS5A蛋白或NS5B聚合酶來抑制HCV復(fù)制，而對免疫系統(tǒng)無直接影響[5]。因此，研究應(yīng)用DAAs治療CHC過程中NK細(xì)胞亞群、表型以及功能的變化對于闡明NK細(xì)胞在慢性HCV感染中的作用具有重要意義。

1 HCV的病毒學(xué)特征及基因型

HCV屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬，是單股正鏈RNA病毒，長度約為9 600 bp。HCV RNA基因組具有5′端及3′端的非編碼區(qū)。一個(gè)開放的閱讀框被非編碼區(qū)包圍，并通過5′端的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)翻譯成多聚蛋白。多聚蛋白被宿主及病毒蛋白酶裂解產(chǎn)生3種結(jié)構(gòu)蛋白(core、E1、E2)與7種非結(jié)構(gòu)蛋白(p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。HCV核心蛋白形成包裹著RNA基因組的衣殼。E1、E2蛋白構(gòu)成病毒的囊膜，包繞在核衣殼外。其他非結(jié)構(gòu)蛋白不被整合進(jìn)病毒顆粒中，但在病毒蛋白的加工以及基因組的復(fù)制中起重要作用。NS3-4A復(fù)合體是一種絲氨酸蛋白酶，用以裂解多聚蛋白形成獨(dú)立的非結(jié)構(gòu)蛋白。NS5B是病毒RNA復(fù)制所需的RNA聚合酶。NS5A是病毒復(fù)制以及病毒顆粒組裝的調(diào)節(jié)蛋白[6]。DAAs通過抑制HCV的NS3-4A絲氨酸蛋白酶(telaprevir、boceprevir、simeprevir、asunaprevir等)、NS5B聚合酶(如sofosbuvir、dasabuvir)或NS5A蛋白(ledipasvir、ombitasvir、daclatasvir等)來抑制病毒的復(fù)制[6]。

HCV可以按不同基因型分類為7類[7]，除基因型5和7以外，其余基因型均可進(jìn)一步分為不同亞型。不同基因型顯示出不同的地理分布特征。一般，基因型1、2、3在全球范圍內(nèi)普遍流行，基因型4、5主要分布在非洲，基因型6主要在東南亞國家流行[2,7]。在中國，超過95%的HCV基因型屬于以下5種主要亞型：1b、2a、3a、3b、6a。其中，大約75%的HCV感染屬于基因型1b，其次為2a[8]。

2 慢性HCV感染患者NK細(xì)胞亞群、表型及功能的改變

NK細(xì)胞是人類機(jī)體抗病毒、抗腫瘤先天免疫的重要組成部分[9]。NK細(xì)胞可以產(chǎn)生細(xì)胞脫顆粒作用，釋放穿孔素及顆粒酶來溶解病毒感染的細(xì)胞[10]。同時(shí)，NK細(xì)胞還可以通過腫瘤壞死因子相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)靶細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡[11]。除細(xì)胞毒性作用外，NK細(xì)胞還可以分泌許多具有抗病毒作用的細(xì)胞因子，如γ干擾素及腫瘤壞死因子-α[12]。

傳統(tǒng)的NK細(xì)胞被定義為CD56+CD3-的淋巴細(xì)胞，并可以根據(jù)CD56的表達(dá)水平進(jìn)一步分為CD56bright亞群和CD56dim亞群。最近，又有一群以CD56-CD3-CD16+為特點(diǎn)的NK細(xì)胞在慢性病毒感染中被發(fā)現(xiàn)，并定義為CD56neg亞群[13]。有研究表明，在CHC患者中，CD56bright亞群百分比升高，而CD56dim亞群百分比降低[14]。CD56neg亞群在正常人群中僅占整體NK細(xì)胞的5%左右，而在HCV感染后能升至10%～40%[4]。

NK細(xì)胞的活性和功能受許多抑制性和激活性受體的共同調(diào)控。抑制性受體包括NKG2A以及殺傷免疫球蛋白樣受體等，可以下調(diào)病毒感染細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子，進(jìn)而抑制NK細(xì)胞的殺傷作用。其他受體如NKG2C/D、NKp30、NKp44、NKp46等屬于激活性受體，在HCV感染時(shí)可以傳遞激活信號(hào)，并將NK細(xì)胞誘導(dǎo)至活化狀態(tài)[14]。對于CHC患者NK細(xì)胞表型的變化，不同研究得出的結(jié)果存在較大爭議。有研究表明，在CHC患者外周血及肝內(nèi)NK細(xì)胞表面，NKp46的表達(dá)水平顯著上升[15]。NKp46高表達(dá)(NKp46high)NK細(xì)胞具有更高的細(xì)胞毒性以及γ干擾素分泌能力。NKp46highNK細(xì)胞在CHC患者肝組織中大量富集，并加強(qiáng)表達(dá)對HCV感染細(xì)胞及參與肝纖維化的肝星狀細(xì)胞的殺傷能力[16]。其他NK細(xì)胞激活性受體，如NKG2D、NKG2C、NKp30、NKp44，也在慢性HCV感染患者NK細(xì)胞表面表達(dá)升高[15,17]。然而，仍有大量研究表明，CHC患者NK細(xì)胞表面激活性受體，如NKG2D、NKp30、NKp46的表達(dá)水平下調(diào)，而抑制性受體NKG2A及KLRG1表達(dá)水平升高[18]。

在慢性HCV感染過程中，NK細(xì)胞處于一種持續(xù)被激活的狀態(tài)[15]。然而，并不是所有NK細(xì)胞的功能均增強(qiáng)。有研究表明，在慢性HCV感染過程中，NK細(xì)胞的殺傷作用增強(qiáng)，而γ干擾素分泌作用減弱[15,17]。慢性HCV感染導(dǎo)致內(nèi)源性α干擾素增加，進(jìn)而上調(diào)NK細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducers and activators of transcription 1，STAT1)的表達(dá)水平。同時(shí)，積累的 α干擾素還會(huì)誘導(dǎo)STAT1優(yōu)先磷酸化，而降低STAT4的磷酸化水平。磷酸化的STAT1(pSTAT1)會(huì)加強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞殺傷作用，而缺少的pSTAT4則會(huì)減弱γ干擾素的分泌作用[19]。同時(shí)，仍有文獻(xiàn)指出，CHC患者中NK細(xì)胞脫顆粒作用及腫瘤壞死因子相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體表達(dá)下降，而γ干擾素分泌能力增加[20]。

不同研究隊(duì)列中，CHC患者NK細(xì)胞表型及功能的改變存在較大差異。目前出現(xiàn)這種差異的原因尚未研究清楚，但可能與患者數(shù)目及篩選方法的差異有關(guān)[12,21]。

3 HCV與NK細(xì)胞間的相互作用

HCV與NK細(xì)胞之間的直接或間接作用是導(dǎo)致NK細(xì)胞狀態(tài)改變的主要原因。有研究表明，貼壁的E2病毒蛋白使NK細(xì)胞表面CD81交聯(lián)，從而抑制NK細(xì)胞的效應(yīng)功能[22]。貼壁的HCV顆粒同樣也可以抑制NK細(xì)胞的功能，而游離的病毒顆粒卻無此作用[23]。表明，HCV E2蛋白可以促進(jìn)CD81交聯(lián)，并抑制NK細(xì)胞功能。然而體外研究與體內(nèi)環(huán)境有所不同，CD81交聯(lián)需要HCV顆粒固定，并且需要達(dá)到很高的濃度，這些條件在體內(nèi)很難滿足。

除了HCV直接與NK細(xì)胞相互作用外，NK細(xì)胞與HCV感染的肝癌細(xì)胞直接接觸會(huì)導(dǎo)致NK細(xì)胞功能的降低[24]。NK細(xì)胞在體外與HCV感染細(xì)胞接觸后，NK細(xì)胞表面激活性受體NKG2D與NKp30表達(dá)水平下調(diào)，從而在體外抑制了NK細(xì)胞的功能與活性[25]。同時(shí)，被外源性α干擾素激活的NK細(xì)胞可以殺死HCV感染的肝癌細(xì)胞[26]。說明在研究NK細(xì)胞與HCV感染細(xì)胞間相互作用時(shí)，一些先天免疫細(xì)胞因子的作用不容忽視，包括α干擾素、β干擾素、白細(xì)胞介素(interleukin, IL)8、IL-12、IL-15、IL-18[27]。

由免疫輔助細(xì)胞產(chǎn)生的α干擾素及其他細(xì)胞因子可能會(huì)調(diào)控NK細(xì)胞與HCV感染的肝細(xì)胞間的相互作用。NK細(xì)胞被病原體激活需要輔助細(xì)胞分泌細(xì)胞因子協(xié)助，這類輔助細(xì)胞包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、傳統(tǒng)樹突狀細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞等[28]。有研究表明，在肝臟中，Kupffer細(xì)胞可以作為輔助細(xì)胞察覺病毒RNA，并分泌一些細(xì)胞因子來間接激活NK細(xì)胞[29]。此外，輔助細(xì)胞在與HCV感染的肝癌細(xì)胞相互作用后還可以調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的γ干擾素分泌能力。有研究表明，漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞分泌的α干擾素可以激活NK細(xì)胞分泌γ干擾素[30]。說明，輔助細(xì)胞分泌的α干擾素也可以逆轉(zhuǎn)HCV感染細(xì)胞對NK細(xì)胞產(chǎn)生的直接抑制作用。漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞可以識(shí)別HCV感染細(xì)胞分泌的外泌體中的HCV RNA并釋放Ⅰ類干擾素[31]。因此，HCV感染細(xì)胞、NK細(xì)胞以及漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞之前的相互作用會(huì)對NK細(xì)胞同時(shí)產(chǎn)生激活性的以及抑制性的信號(hào)，而這兩種信號(hào)間的平衡決定了NK細(xì)胞的激活狀態(tài)。此外，還有文獻(xiàn)報(bào)道，單核細(xì)胞接觸HCV感染細(xì)胞后釋放IL-18，IL-18激活NK細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素[32]。病毒NS5A蛋白通過Toll樣受體-4刺激單核細(xì)胞分泌免疫抑制細(xì)胞因子IL-10，而抑制激活性細(xì)胞因子IL-12的分泌。IL-10會(huì)刺激 TGF-β 分泌的增加，TGF-β則會(huì)下調(diào)NK細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá)水平。這些研究中的爭論可能由于實(shí)驗(yàn)方法不同導(dǎo)致，有待進(jìn)一步研究。

4 應(yīng)用DAAs治療對CHC患者NK細(xì)胞狀態(tài)的影響

目前為止，關(guān)于DAAs治療對CHC患者的免疫影響的研究還較少，結(jié)論尚存在很多爭議。在DAAs治療初期，NK細(xì)胞及各亞群百分比并無顯著變化[33]。而在DAAs治療較后期甚至停藥后，NK細(xì)胞亞群、表型以及功能指標(biāo)均有明顯變化。有研究表明，CHC患者應(yīng)用達(dá)卡他韋/阿舒瑞韋治療方案時(shí)，在治療第12周可以觀察到CD56bright百分比顯著降低，CD56dim百分比顯著升高[8]。提示，在DAAs治療過程中，NK細(xì)胞亞群的變化是一個(gè)由主要發(fā)揮細(xì)胞因子分泌及免疫調(diào)節(jié)作用的群體(即CD56bright亞群)逐漸向主要發(fā)揮細(xì)胞毒性作用的群體(即CD56dim亞群)的過程。同時(shí)，也有研究指出，在DAAs治療過程中，NK細(xì)胞及各亞群的百分比并無顯著變化[34]。

NK細(xì)胞表型及功能在DAAs治療后期發(fā)生顯著變化，使NK細(xì)胞整體的活化狀態(tài)趨于正常化，即接近健康人群水平。有研究表明，CHC患者NK細(xì)胞表面HLA-DR、CD85j、NKp46、NKG2A顯著高于健康人群，而在應(yīng)用達(dá)卡他韋/阿舒瑞韋治療方案第8周時(shí)，上述表面標(biāo)志的表達(dá)水平均顯著降低，呈現(xiàn)正?；厔荨Ｅc此同時(shí)，NK細(xì)胞脫顆粒能力，即pSTAT1、腫瘤壞死因子相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體的表達(dá)水平顯著下降，而細(xì)胞因子分泌能力，即γ干擾素、腫瘤壞死因子-α的表達(dá)水平顯著上升，顯示出NK細(xì)胞的活化狀態(tài)正?；痆34]。也有相關(guān)文獻(xiàn)指出，在DAAs治療過程中，NKp30、NKp46以及NKG2A的表達(dá)水平呈線性下降趨勢，并且在治療第12周時(shí)與健康人群比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[14]。

此外，經(jīng)過抗病毒治療后，HCV感染引起的先天免疫應(yīng)答激活狀態(tài)被打破，體內(nèi)干擾素的平衡狀態(tài)得到修復(fù)，NK細(xì)胞對內(nèi)源性干擾素的應(yīng)答效應(yīng)也顯著提高[35]。

5 NK細(xì)胞狀態(tài)的變化與DAAs應(yīng)用中產(chǎn)生的臨床問題

在應(yīng)用DAAs治療CHC患者過程中尚存在許多臨床問題與爭議，如HBV/HCV共感染患者HBV再激活問題、CHC患者再感染及肝癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加的問題。研究DAAs治療過程中先天免疫系統(tǒng)的改變對于解釋并解決這些問題存在一定的指導(dǎo)意義。

由于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)與HCV的傳播途徑相同，HBV/HCV共感染并不罕見，尤其是在靜脈吸毒者、接受血液透析的患者、接受臟器移植的患者、人類免疫缺陷病毒陽性患者以及β-珠蛋白生成障礙性貧血患者等高危人群中[36]。與干擾素治療類似，DAAs治療也會(huì)引起HBV/HCV共感染患者的HBV再激活，嚴(yán)重程度從無肝炎的HBV再激活到需要進(jìn)行肝移植的爆發(fā)性肝衰竭不等[37]。關(guān)于HBV/HCV共感染患者在接受DAAs治療后發(fā)生HBV再激活的機(jī)制尚存在許多爭議，與中國的研究不同[38]，日本學(xué)者研究表明，只有乙型表面抗原陽性的HBV/HCV共感染患者發(fā)生HBV再激活的風(fēng)險(xiǎn)較高，而乙型表面抗原陰性的共感染患者經(jīng)過DAAs治療后罕見HBV再激活[39]。

當(dāng)患者同時(shí)感染HBV與HCV時(shí)，HCV往往占主導(dǎo)地位，表現(xiàn)為HCV載量高，而HBV DNA水平較低甚至無法檢測?；颊呤褂肈AAs進(jìn)行治療后，HCV得到清除，兩種病毒間的競爭被打破，使得HBV得以復(fù)制、再激活，并更具攻擊性。同時(shí)，患者感染HCV時(shí)，免疫系統(tǒng)高度激活。當(dāng)HCV清除后，患者的免疫系統(tǒng)活化狀態(tài)降低，HBV可能得以逃逸、取代免疫系統(tǒng)的控制，發(fā)生HBV再激活[40]。NK細(xì)胞是機(jī)體先天免疫系統(tǒng)中重要的組成部分，NK細(xì)胞的表型、功能在HCV感染患者接受DAAs治療后發(fā)生顯著變化。目前尚無揭示NK細(xì)胞在HBV/HCV共感染患者接受抗病毒治療后HBV再激活這一現(xiàn)象中的作用的報(bào)道。DAAs治療不直接影響免疫系統(tǒng)功能[5]，是研究HBV/HCV共感染患者接受抗病毒治療后HBV再激活的良好的模型。

另一個(gè)DAAs治療過程中存在的問題與爭議是CHC患者應(yīng)用DAAs治療后肝癌早期發(fā)生及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的增加。HCV感染是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的主要原因之一[41]。使用干擾素/利巴韋林方案治療CHC患者時(shí)，即使沒有達(dá)到SVR，或HCC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)沒有被完全消除，也被大大降低[42]。而有研究指出，CHC患者接受DAAs治療后發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)增高[43]。同時(shí)，與干擾素/利巴韋林治療方案不同，DAAs治療無法降低曾患HCC患者的HCC復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[44]，甚至達(dá)到SVR的患者HCC復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更高[45]。因此，對于曾患HCC的患者，即使應(yīng)用DAAs治療CHC達(dá)到SVR，仍存在HCC復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，需進(jìn)行長期隨訪觀察。而DAAs本身是否與HCC風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)有待進(jìn)一步研究[46]。然而，DAAs治療后并不能增加CHC患者HCC早期發(fā)生與復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[47]。對于DAAs治療達(dá)到SVR的患者，HCC風(fēng)險(xiǎn)與基線的危險(xiǎn)因素有關(guān)，而與DAAs治療無關(guān)[48]。

關(guān)于DAAs可能引起HCC風(fēng)險(xiǎn)增加的機(jī)制尚無定論。傳統(tǒng)的α干擾素/利巴韋林治療方案對免疫系統(tǒng)具有顯著的調(diào)節(jié)作用，干擾素的免疫調(diào)節(jié)作用與抗腫瘤作用可以對抗惡性細(xì)胞增殖，減少HCC的風(fēng)險(xiǎn)[49]。DAAs治療方案則與之不同。有研究認(rèn)為，應(yīng)用DAAs快速治愈HCV感染會(huì)降低患者機(jī)體免疫監(jiān)視水平，增加HCC的風(fēng)險(xiǎn)[50]。同時(shí)，有文獻(xiàn)指出，DAAs治療與HCV特異性的記憶性T細(xì)胞去分化、淋巴細(xì)胞失活以及NK細(xì)胞功能正?；嚓P(guān)，可能影響免疫系統(tǒng)對HCC的抵抗作用[14,34]。近期還有文獻(xiàn)指出，患者治療前NKG2D的表達(dá)水平以及治療過程中的變化對HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有預(yù)測價(jià)值[51]。研究DAAs治療過程中NK細(xì)胞表型與功能的改變對于解釋、闡明HCC發(fā)生與復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的改變有重要意義。

6 小 結(jié)

NK細(xì)胞是人體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在慢性HCV感染及后續(xù)的抗病毒治療中NK細(xì)胞的表型與功能均發(fā)生顯著變化。在DAAs治療后期，NK細(xì)胞的整體活化狀態(tài)趨于正?；?xì)胞毒作用顯著下降，可能與HBV/HCV共感染患者HBV再激活、再感染以及HCC的發(fā)生與復(fù)發(fā)有關(guān)。與干擾素不同，DAAs直接作用于HCV的復(fù)制周期本身，尚未發(fā)現(xiàn)對免疫系統(tǒng)有直接影響。因此，DAAs是研究NK細(xì)胞在HCV感染中作用的一種有效手段。研究NK細(xì)胞在DAAs治療過程中的變化對于解釋、闡明HBV/HCV共感染患者HBV再激活以及HCC的發(fā)生與復(fù)發(fā)等DAAs治療中的問題與爭議有重要價(jià)值。