王 靜，劉 燕，吳世德，楊海霞，王秀珍*

（1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；2. 山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司 山東省黏膜與皮膚給藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；3. 山東明仁福瑞達(dá)制藥股份有限公司 山東省骨科疼痛類(lèi)藥物工程研究中心，山東 濟(jì)南 250101）

鹽酸卡替洛爾（carteolol hydrochloride），化學(xué)名為5-[3-[(1,1-二甲基乙基)氨基]-2-羥丙氧基]-3,4-二氫-2（1H）-喹諾酮鹽酸鹽，是一種具有內(nèi)在擬交感活性和膜穩(wěn)定作用的β-腎上腺素受體阻斷劑，在治療心律不齊、心絞痛、高血壓、青光眼、心臟神經(jīng)癥和法洛四聯(lián)癥等疾病有顯著療效[1-2]。鹽酸卡替洛爾用途廣泛，目前已被開(kāi)發(fā)的劑型有滴眼劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑等。其原料藥及制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)雖已被多個(gè)國(guó)家藥典及國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)收錄[3-9]，但有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法均不夠完善。本研究根據(jù)其合成路線[10]（見(jiàn)圖1）、降解途徑并參考各國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)，建立了新的鹽酸卡替洛爾有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，能將鹽酸卡替洛爾與已知雜質(zhì)、中間體、強(qiáng)制降解雜質(zhì)全部分開(kāi)，分離度符合要求；并參考相關(guān)指導(dǎo)原則，對(duì)本法進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證。

圖1 鹽酸卡替洛爾合成路線圖

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津，帶有SPD-M20A檢測(cè)器、LC-20AD泵、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器）；AT261電子分析天平（瑞士梅特勒）。

1.2 試藥

鹽酸卡替洛爾（山東省藥學(xué)科學(xué)院，批號(hào)：170801、170802、170803）；中間體I[3-氨基-2-環(huán)己烯酮，山東省藥學(xué)科學(xué)院，批號(hào)：170715]；中間體II[3,4,7,8-四氫-2,5(1H,6H）-喹啉二酮，山東省藥學(xué)科學(xué)院，批號(hào)：170716]；中間體III[5-羥基-3,4-二氫-2(1H)-喹諾酮，山東省藥學(xué)科學(xué)院，批號(hào)：170717]；中間體IV[5-(2,3-環(huán)氧丙氧基)-3,4-二氫-2(1H)-喹諾酮，山東省藥學(xué)科學(xué)院，批號(hào)：170718]；鹽酸卡替洛爾對(duì)照品（USP，批號(hào)：G0F326，含量99.70 %）；雜質(zhì)H（TLC PHARMACHEM，批號(hào)：1647-040A3，純度99.97 %）；乙腈、己烷磺酸鈉均為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SunFireTMC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：252 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量：20 μl；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，己烷磺酸鈉溶液（取己烷磺酸鈉2.5 g，醋酸銨2 g，加水溶解并稀釋至1000 ml，用醋酸調(diào)pH 4.0 ±0.1）為流動(dòng)相B，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取鹽酸卡替洛爾適量，用50 %甲醇溶解并稀釋制成每1 ml中約含鹽酸卡替洛爾2 mg溶液，作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照溶液的制備 精密量取供試品溶液適量，用50 %甲醇定量稀釋制成每1 ml中約含鹽酸卡替洛爾20 μg溶液，作為對(duì)照溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性溶液的制備 精密稱(chēng)取鹽酸卡替洛爾對(duì)照品和雜質(zhì)H對(duì)照品各適量，用50 %甲醇溶解并稀釋制成每1 ml中約含鹽酸卡替洛爾2 mg與雜質(zhì)H 20 μg混合溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn)溶液的制備 分別取鹽酸卡替洛爾對(duì)照品、起始原料、中間體I、中間體II、中間體III、中間體IV、雜質(zhì)H[7]適量，精密稱(chēng)定，用50 %甲醇溶解并稀釋制成起始原料濃度約為9.03 μg/ml、中間體I濃度約為5.41 μg/ml、中間體II濃度約為62.5 μg/ml、中間體III濃度約為27.55 μg/ml、中間體IV濃度約為33.35 μg/ml、雜質(zhì)H濃度約為5.38 μg/ml、鹽酸卡替洛爾濃度約為1.987 mg/ml的混合溶液，作為專(zhuān)屬性試驗(yàn)溶液。

2.2.5 強(qiáng)制降解試驗(yàn) 酸降解：取鹽酸卡替洛爾20.48 mg，置10 ml量瓶，加2 ml 50 %甲醇溶解，搖勻，加2 mol/L鹽酸溶液2 ml，混勻，80 ℃水浴放置10 d，冷卻至室溫，用2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至近中性，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

堿降解：取鹽酸卡替洛爾19.99 mg，置10 ml量瓶，加2 ml 50 %甲醇溶解，搖勻，加2 mol/L氫氧化鈉溶液2 ml，混勻，80 ℃水浴放置10 d，冷卻至室溫，用2 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至近中性，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

氧化降解：取鹽酸卡替洛爾20.26 mg，置10 ml量瓶，加2 ml 50 %甲醇溶解，搖勻，加30 %雙氧水溶液0.5 ml，混勻，70 ℃水浴放置16 h，加50 %甲醇稀釋至10 ml，搖勻，即得。

光照降解：取鹽酸卡替洛爾20.33 mg，置10 ml量瓶，加2 ml 50 %甲醇溶解，搖勻，置可見(jiàn)光燈（光照強(qiáng)度約為4500 Lx）下照射10 d，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

高溫降解：取鹽酸卡替洛爾20.13 mg，置10 ml量瓶，加2 ml 50 %甲醇溶解，搖勻，80 ℃水浴放置10 d，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取系統(tǒng)適用性溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，鹽酸卡替洛爾峰與雜質(zhì)H峰的分離度應(yīng)≥1.5。

取各破壞后的樣品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，鹽酸卡替洛爾峰與各中間體峰、起始原料峰能達(dá)到良好分離，且各降解雜質(zhì)峰與主峰均能達(dá)到良好分離，該色譜條件用于鹽酸卡替洛爾有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定有良好的專(zhuān)屬性。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)與強(qiáng)制降解試驗(yàn)的HPLC譜圖

2.3.2 雜質(zhì)H線性關(guān)系試驗(yàn) 精密稱(chēng)取雜質(zhì)H對(duì)照品適量，甲醇溶解，并分別稀釋配制成質(zhì)量濃度為0.02，0.04，0.4，0.8，4.0，10.0 μg/ml 6個(gè)不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以濃度C（μg/ml）對(duì)峰面積A進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程：A=52658C-90.709（r=1.0000）。表明雜質(zhì)H濃度在0.02～10.0 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.3 鹽酸卡替洛爾線性關(guān)系試驗(yàn) 精密稱(chēng)取鹽酸卡替洛爾對(duì)照品適量，50 %甲醇溶解，并分別稀釋配制成質(zhì)量濃度為0.0079，0.0198，0.396，1.982，9.908，19.816，39.632 μg/ml 6個(gè)不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以濃度C（μg/ml）對(duì)峰面積A進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程：A=48720C+2625.1（r=0.9999）。表明鹽酸卡替洛爾濃度在0.0079～39.632 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.4 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)供試品溶液，分別于配制0，3，6，9，12，24 h后，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。按鹽酸卡替洛爾峰面積計(jì)算RSD為0.34 %，單個(gè)雜質(zhì)及總雜質(zhì)均無(wú)明顯變化，且無(wú)新雜質(zhì)峰出現(xiàn)。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 對(duì)照溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)對(duì)照溶液，分別于配制0，3，6，9，12，24 h后，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。按鹽酸卡替洛爾峰面積計(jì)算RSD為0.52 %，結(jié)果表明，對(duì)照溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)對(duì)照溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。按鹽酸卡替洛爾峰面積計(jì)算RSD為0.31 %（n=6）。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.3.7 雜質(zhì)H定量限和檢測(cè)限測(cè)定 精密稱(chēng)取雜質(zhì)H對(duì)照品，加甲醇溶解并稀釋得7.8 ng/m的溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，得到雜質(zhì)H的峰高約為基線噪音的10倍。再精密量取該溶液3 ml置10 ml量瓶，甲醇稀釋至刻度，搖勻，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，得到雜質(zhì)H的峰高約為基線噪音的3倍。結(jié)果表明，雜質(zhì)H在該色譜條件下的定量限為7.8 ng/ml，檢測(cè)限為2.3 ng/ml。

2.3.8 雜質(zhì)H校正因子測(cè)定 按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定法，根據(jù)“2.3.2”、“2.3.3”項(xiàng)下得到的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，兩曲線斜率之比即為雜質(zhì)H的校正因子，值為1.08。雜質(zhì)H的校正因子在0.9～1.1的范圍內(nèi)，可直接采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算其含量。

2.3.9 雜質(zhì)H回收率 取鹽酸卡替洛爾對(duì)照品約20 mg，共9份，精密稱(chēng)定，置9個(gè)10 ml容量瓶中，加50%甲醇約5 ml，振搖使溶解，分別精密加入雜質(zhì)H儲(chǔ)備液適量，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成雜質(zhì)H濃度分別為0.432 μg/ml、4.32 μg/ml、8.64 μg/ml的三個(gè)低、中、高濃度水平的溶液，每個(gè)濃度3份。按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果雜質(zhì)H的平均回收率為102.9 %，RSD為1.03 %（n=9），表明該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，符合要求。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 雜質(zhì)H回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.10 耐用性試驗(yàn) 取2.2.3項(xiàng)系統(tǒng)適用性溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件，分別調(diào)整緩沖液的pH值、流動(dòng)相中緩沖液與乙腈的比例、流速等條件，同法測(cè)定，考察鹽酸卡替洛爾峰與雜質(zhì)H峰之間的分離度。結(jié)果表明，鹽酸卡替洛爾均能與雜質(zhì)H完全分離，該法耐用性好。

2.4 鹽酸卡替洛爾有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

取本品3批，照2.2.1項(xiàng)制備供試品溶液和2.2.2項(xiàng)制備對(duì)照溶液。按2.1項(xiàng)色譜條件，分別量取供試品溶液和對(duì)照溶液各20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按不加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的含量。3批樣品的總雜質(zhì)含量分別為0.23 %，0.18 %，和0.19 %，雜質(zhì)H含量分別為0.026 %，0.023 %和0.026 %，最大雜質(zhì)含量分別為0.093 %，0.086 %和0.082 %。

3 討論

3.1 照2.2.1項(xiàng)配制鹽酸卡替洛爾2 mg/ml溶液，以溶劑為空白，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定紫外吸收光譜。由結(jié)果可見(jiàn)，鹽酸卡替洛爾在215 nm和252 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收。由強(qiáng)制降解試驗(yàn)可見(jiàn)，本品在強(qiáng)堿、強(qiáng)光及高溫條件下較穩(wěn)定，在氧化、強(qiáng)酸條件下較不穩(wěn)定。

3.2 雜質(zhì)H峰作為離鹽酸卡替洛爾峰最近的雜質(zhì)，且是強(qiáng)制降解得到的主要雜質(zhì)，將其定入系統(tǒng)適用性溶液。

3.3 本法可將鹽酸卡替洛爾與合成路線中的起始原料、中間體及降解雜質(zhì)完全分離；有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果表明，3批樣品的單個(gè)雜質(zhì)均小于0.1 %，雜質(zhì)H均小于0.2 %，總雜質(zhì)均小于0.5 %，且雜質(zhì)個(gè)數(shù)及種類(lèi)一致，批間測(cè)定結(jié)果差異較小，說(shuō)明本品的合成工藝成熟、穩(wěn)定。