符 敏，劉晶晶，荊 鳴，蔡馥伊，姚雪敏，程 嵐，李學濤

（遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600）

大黃素是大黃、望江南、虎杖等多種中藥的主要活性成分之一，具有抑菌、消炎及瀉下等藥理作用[1]。近年，關(guān)于大黃素抗腫瘤活性的研究日益增多，可從多種途徑、多個靶點發(fā)揮療效，其作用機制主要與抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡等途徑相關(guān)[2]。然而，大黃素在體內(nèi)生理環(huán)境pH下溶解度低，很難通過血液運輸被機體腫瘤組織吸收[3-4]。脂質(zhì)體作為一種新型藥物載體，利用磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)對藥物進行包載，可提高難溶性藥物的溶解度，降低藥物毒性，改善藥物在體內(nèi)的分布，從而提高大黃素的體內(nèi)生物利用度及腫瘤治療效果[5]。R8GD多肽是一種小分子的細胞穿膜肽，毒性低，且不會產(chǎn)生細胞膜永久性損傷，能有效地將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運穿過細胞膜，提高細胞對脂質(zhì)體中藥物的攝取及藥物對細胞的靶向作用[6]。二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）的PEG親水基團鑲嵌在脂質(zhì)體表面，使脂質(zhì)體親水性增強并形成一定的空間位阻，減少血漿蛋白與脂質(zhì)體膜的相互作用，從而減緩藥物在體內(nèi)的清除速率，延長大黃素在循環(huán)系統(tǒng)的滯留時間[7]。本實驗采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選R8GD多肽修飾大黃素脂質(zhì)體的最佳處方，并用HPLC測定R8GD多肽修飾大黃素脂質(zhì)體中的藥物含量，從而對制劑進行質(zhì)量控制。

1 材料

1.1 儀器

FA1004型電子天平（上海越平）；電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械公司醫(yī)療器械五廠）；SG3300H型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器公司）；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；JY92-2D型超聲波細胞搗碎機（寧波新芝）；20AT型液相色譜儀（UV檢測器，島津色譜工作站，日本島津）；葡聚糖凝膠（Sephadex）G-50柱（上海華藍）；C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，上海月旭）。

1.2 藥品與試劑

大黃素（大連美侖，批號：MB5674）；蛋黃卵磷脂（EPC，日本NF公司，批號：120015）；膽固醇（Chol，大連美侖，批號：MB6750）；DSPE-PEG2000（相對分子質(zhì)量2800.5，日本精化株式會社，批號：B10206）；DSPE-PEG2000-R8GD（遼寧中醫(yī)藥大學實驗室合成）。

2 方法與結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的制備

薄膜-超聲分散法制備脂質(zhì)體。精密稱取處方量的EPC、Chol、DSPE-PEG2000，用氯仿溶解于圓底燒瓶中，40 ℃水浴減壓蒸發(fā)除去氯仿，用pH 7.2，濃度0.01 mol/L的PBS水溶液5 ml 將圓底燒瓶底部形成的脂質(zhì)膜充分水化，然后將水化液轉(zhuǎn)至10 ml EP管中，置超聲波細胞搗碎機中超聲（超聲5 s，間歇5 s，功率500 W）10 min，過0.22 μm微孔濾膜2次，即得空白脂質(zhì)體。制備R8GD多肽修飾大黃素脂質(zhì)體。精密稱取處方量的EPC、Chol、DSPE-PEG2000、大黃素和DSPE-PEG2000-R8GD，用氯仿溶解于圓底燒瓶中，其他操作與空白脂質(zhì)體制備同。4 ℃密封保存。

2.2 大黃素含量測定方法學研究

2.2.1 溶液的制備

2.2.1.1 空白溶液的制備 按2.1項方法制備空白脂質(zhì)體，精密吸取空白脂質(zhì)體1 ml于10 ml量瓶中，甲醇定容，超聲破乳，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.2 供試品溶液的制備 精密吸取1 ml R8GD多肽修飾大黃素脂質(zhì)體于10 ml量瓶中，甲醇定容，超聲破乳，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.3 對照品溶液的制備 精密稱取大黃素對照品0.24 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容。另用甲醇配制濃度為5，10，15，20，25，30，35 μg/ml系列對照品溶液。

2.2.2 色譜條件 色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6mm，5 μm，上海月旭）；流動相：甲醇-水（80:20）；進樣量：20 μl；檢測波長：254 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；理論塔板數(shù)：以大黃素的色譜峰計算不得低于3000。

2.2.3 標準曲線的建立 分別精密吸取大黃素對照品溶液，按2.2.2項下色譜條件測定，記錄對照品峰面積，然后以對照品的濃度（μg/ml）為橫坐標，相應(yīng)的峰面積為縱坐標進行線性回歸。得大黃素的線性回歸方程為Y=128 391X+18 016，（r=0.9996，n=7）。結(jié)果表明：大黃素對照品在5～35 μg/ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 重復性實驗 精密吸取R8GD多肽修飾大黃素脂質(zhì)體1 ml，按2.2.1.2項方法制備供試品溶液，按2.2.2項色譜條件進樣分析（n=5）。結(jié)果大黃素峰面積的RSD為0.94 %，說明該方法的重復性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一供試品溶液，按2.2.2項下色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h進樣分析，測定相應(yīng)的峰面積。結(jié)果大黃素峰面積的RSD為1.03 %；說明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 加樣回收率實驗 將空白脂質(zhì)體與等體積的濃度為480.00 μg/ml的大黃素對照品溶液混勻，按2.2.1.2項方法制備供試品溶液，按2.2.2項色譜條件進樣分析（n=5）。計算得脂質(zhì)體中大黃素平均加樣回收率為97.20 %，RSD為0.94 %，結(jié)果表明該方法符合含量測定方法要求。

2.3 包封率測定

過柱前脂質(zhì)體：精密吸取 R8GD多肽修飾大黃素脂質(zhì)體0.5 ml，置入5 ml量瓶中，PBS定容。將該脂質(zhì)體稀釋液與5 ml甲醇混勻，超聲破乳，然后過0.22 μm微孔濾膜，作為過柱前樣品備用。按2.2.2項色譜條件測定。

過柱后脂質(zhì)體：稱取2.0 g Sephadex G-50，于PBS中浸泡24 h，使其充分溶脹，濕法裝柱（10 cm×1.5 cm）備用。待凝膠柱上柱面與PBS液面平齊時，精密吸取0.5 ml R8GD多肽修飾大黃素脂質(zhì)體上柱，PBS緩慢洗脫，用5 ml量瓶收集橙色部分洗脫液，之后用PBS定容，混勻。將該脂質(zhì)體稀釋液與5 ml甲醇混勻，超聲破乳，過0.22 μm微孔濾膜，按2.2.2項色譜條件測定，每個脂質(zhì)體重復過柱3次，并按下式計算包封率。

包封率（%）=過柱后脂質(zhì)體中藥物含量/過柱前脂質(zhì)體中藥物含量×100 %

2.4 處方優(yōu)選

根據(jù)單因素考察結(jié)果，選擇對脂質(zhì)體中大黃素包封率影響較顯著的3個因素作為考察因素，包括EPC/Chol（質(zhì)量比，X1）、EPC/大黃素（質(zhì)量比，X2）、超聲波細胞搗碎機的功率（X3），并確定其用量范圍為：X1：3.0～7.0，X2：10～20，X3：300～700。采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法可連續(xù)對各個水平進行分析。根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，以大黃素包封率（Y）作為測定指標進行考察。試驗設(shè)計及結(jié)果見表1、表2。

表1 因素與水平（處方量為5 ml）

表2 星點設(shè)計與結(jié)果

將表2中數(shù)據(jù)輸入Design-Expert8.0.6.1軟件，擬合方程為Y=-248.91263+ 79.94188X1說明模型能很好地反映響應(yīng)值的變化，可用于分析和預測R8GD多肽修飾大黃素脂質(zhì)體的最優(yōu)處方。對上述擬合模型進行顯著性檢驗，結(jié)果顯示，X1、X2、X1X2、、對Y有顯著影響（P＜0.01）；X3、X1X3、X2X3對Y沒有顯著影響（P＞0.05）。固定一個因素的水平為0，使用Design-Expert8.0.6.1軟件生成各因素對脂質(zhì)體包封率影響的三維響應(yīng)面和二維等高線圖，響應(yīng)面圖見圖1，等高線圖見圖2。由圖1和圖2可見，在磷脂量固定不變的情況下X3對Y的影響不大，但X1和X2對Y有顯著影響。

根據(jù)最優(yōu)處方制備3批R8GD多肽修飾大黃素脂質(zhì)體，測定包封率。結(jié)果顯示，3批樣品的包封率為95.78 %±0.64 %。表明該處方合理，方法可行。

圖1 各因素對脂質(zhì)體包封率影響的三維響應(yīng)面圖

圖2 各因素對脂質(zhì)體包封率影響的二維等高線圖

2.5 含量測定

精密吸取R8GD多肽修飾大黃素脂質(zhì)體，按2.2.1.2項方法制備供試品溶液，按2.2.2項色譜條件進樣分析，進樣量20 μl，記錄脂質(zhì)體中大黃素的峰面積及含量。結(jié)果見表3。

表3 脂質(zhì)體中藥物含量

脂質(zhì)體中大黃素含量為229.872±1.53 μg/ml，RSD值小于1.0 %。綜上，結(jié)合實驗室脂質(zhì)體處方考察經(jīng)驗及脂質(zhì)體制備的實際要求和脂質(zhì)體性狀等因素，確定最優(yōu)處方為磷脂22 mg、膽固醇4.5 mg、大黃素1.2 mg，處方量為5 ml。

3 討論

體外實驗表明，大黃素對乳腺癌、肝癌、肺癌等多種癌癥都有較好的抑制效果，其作用機制主要與抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡等途徑相關(guān)[8]。同時大黃素對抗腫瘤藥物的治療起到協(xié)同增效作用，還能增加腫瘤細胞對放療的敏感性并減輕其副作用，因此具有較好的臨床應(yīng)用潛能。R8GD多肽是一種小分子細胞穿膜肽，可很好地提高脂質(zhì)體穿過細胞膜的能力，從而發(fā)揮更好的腫瘤靶向治療效果。本實驗為改善大黃素的體內(nèi)水溶性，提高藥物靶向治療效果，制備了R8GD多肽修飾大黃素脂質(zhì)體。

已有的文獻報道中，大黃素HPLC測定的流動相大多為甲醇:0.1 %磷酸溶液（80:20），考慮到色譜柱對酸的耐受性，本實驗將流動相改為甲醇:水，考察85:15、80:20、75:25等配比流動相的分離效果。結(jié)果表明，流動相為甲醇:水（80:20），樣品峰與溶劑峰分離完全且柱效較高，所以本實驗最終確定流動相為甲醇:水（80:20）。

本實驗利用星點設(shè)計-響應(yīng)面法試驗次數(shù)少、試驗精密度高及可連續(xù)對各水平進行分析等特點，對處方進行優(yōu)選。確定制備R8GD多肽修飾大黃素脂質(zhì)體（5 ml）的最優(yōu)處方為磷脂22 mg、膽固醇4.5 mg、大黃素1.2 mg， R8GD多肽4 mg，DSPEPEG20001.5 mg。2015年版《中國藥典》規(guī)定，脂質(zhì)體包封率應(yīng)為80 %以上[9]，經(jīng)驗證該R8GD多肽修飾大黃素脂質(zhì)體最終處方的平均包封率為95.78 %±0.64 %（n=3），表明該R8GD多肽修飾大黃素脂質(zhì)體處方符合質(zhì)量要求。