張群峰 何浣瀅 廖云豪 王國(guó)卿

東北大學(xué) 生命科學(xué)與健康學(xué)院，沈陽(yáng)，110819，中國(guó)

母源毒死蜱（chlorpyrifos，CPF）具有低毒、低殘留等特點(diǎn)，是當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中用量最大、用處最廣的有機(jī)磷農(nóng)藥之一。CPF 進(jìn)入機(jī)體后，會(huì)通過(guò)血液循環(huán)在一些脂溶性組織、器官內(nèi)蓄積。成年SD 大鼠經(jīng)皮下注射CPF 后，在其肝臟中能夠檢出CPF［1］。此外，在腎臟［2］、脾臟［3］等組織中也有CPF 蓄積。但是關(guān)于母源CPF 連續(xù)暴露在子代體內(nèi)的檢測(cè)還未見(jiàn)報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)出生后大鼠幼年期及成年期分別進(jìn)行CPF 暴露，都會(huì)引起其認(rèn)知行為發(fā)生改變，并且伴隨著神經(jīng)化學(xué)變化［4］。有關(guān)CPF 產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用過(guò)去主要集中在其抑制乙酰膽堿酯酶的活性方面［5］。隨著研究的深入，炎癥反應(yīng)在神經(jīng)毒性方面的作用越來(lái)越受到重視［6］。本研究通過(guò)對(duì)母代小鼠進(jìn)行CPF 染毒，對(duì)母代和子代小鼠血液中CPF 進(jìn)行測(cè)定，來(lái)探討CPF 能否通過(guò)母源暴露傳遞到子代，通過(guò)檢測(cè)引起炎癥反應(yīng)通路環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX2）-環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein，CREB）-腦源性 神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）基因和蛋白的變化，來(lái)探討母源暴露CPF 對(duì)子代小鼠產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)CD-1 小鼠，50 只，♀ ♂各半，6 周齡，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［SCXK（京）2016-0011］。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

CPF，購(gòu)自Sigma 公司；橄欖油，購(gòu)自天津甘蒂國(guó)際貿(mào)易有限公司；SPE 萃取小柱，購(gòu)自Agilent Technologies公 司；固 相RNase 清除劑，購(gòu)自Solarbio 公司；Eastep?Super 總RNA 提取試劑盒、GoScriptTMReverse Transcription System、A6001 GoTaq? qPCR Master Mix，均購(gòu)自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；β-Actin（13E5）Rabbit mAb、CREB（48H2）Rabbit mAb，均購(gòu)自Cell Signaling TECHNOLOGY 公司；Rabbit AntiproBDNF polyclonal antibody，購(gòu)自MILLIPORE 公司；COX2 antibody，購(gòu)自abcam 公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L），購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

小鼠飼養(yǎng)7 d 以適應(yīng)環(huán)境，然后25 只雌性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（control 組：不做任何處理）；溶劑組（cpf0組：用橄欖油進(jìn)行灌胃）；給藥組（cpf0.3組：用含0.3 mg·mL-1CPF 的橄欖油進(jìn)行灌胃；cpf0.6組：用含0.6 mg·mL-1CPF 的橄欖油進(jìn)行灌胃；cpf1.2組：用含1.2 mg·mL-1CPF 的橄欖油進(jìn)行灌胃），每組5 只雌性小鼠按照各自組別進(jìn)行妊娠前處理2 周，之后按照雌雄1∶1 比例合籠進(jìn)行交配，次日檢查陰栓情況，母鼠妊娠后按照各自組別進(jìn)行妊娠后處理6 周，至仔鼠斷奶，溶劑組和給藥組母鼠每日給藥劑量10 mL·kg-1，待末次給藥結(jié)束24 h 后，采集母鼠血液，每窩仔鼠采集血液后處死，采集海馬組織。

血液離心分離血清，精密量取血清200 μL，加到預(yù)處理后的SPE 萃取小柱上，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈?，乙腈?fù)溶。色譜條件：①色譜柱：島津WondaSil C18-WR 5 μm，4.6 mm×150 mm；②流動(dòng)相：乙腈-水（90∶10）；③流速：1.0 mL·min-1；④柱溫：30℃；⑤檢測(cè)波長(zhǎng)：229 nm；⑥進(jìn)樣體積：20 μL。按上述色譜條件，制備CPF標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算CPF 濃度。

海馬解凍后，一半用于熒光定量PCR 反應(yīng)，引物序列，見(jiàn)Tab.1。按照說(shuō)明書(shū)操作提取總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為：預(yù)變性：95℃ 30 s→（變 性：95℃ 5 s→退 火：60℃ 30 s→延伸：72℃ 30 s）×40 個(gè)循環(huán)（采集熒光）→溶解曲線階段：95℃ 15 s→60℃ 1 min→95℃ 15 s。另一半用于Western blot 實(shí)驗(yàn)，其中β-actin 及CREB 一抗稀釋比例均為1∶1 000，COX2 抗體稀釋比例為1∶700，BDNF 抗體稀釋比例為1∶3 000。二抗稀釋比例為1∶10 000。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組樣品間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示有顯著性差異，P＜0.01 表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 母代和子代小鼠血漿中CPF 的濃度

母代和子代小鼠血漿中CPF 濃度，在control 組和cpf0組均未檢出，在實(shí)驗(yàn)組母代和子代小鼠血漿中均檢測(cè)出CPF，且組間存在劑量關(guān)系，隨著母代給藥劑量的增加，母代和子代各組小鼠血漿中CPF 含量均有顯著升高，結(jié)果見(jiàn)Tab.2。

Tab.2 CPF concentration in plasma of maternal（n=5）and offspring（n=8）mice（）

Tab.2 CPF concentration in plasma of maternal（n=5）and offspring（n=8）mice（）

Note：Comparison between the same column in the table.The letter of“a，b，c，d”is the superscripe of the expermental data.There is no significant difference between the groups with the same letter（P＞0.05），and there is significant difference between the groups without the same letter（P＜0.01）.

2.2 子代小鼠海馬組織中COX2、CREB 及BDNF mRNA 的表達(dá)

母源CPF 暴露后，子代小鼠海馬組織COX2 mRNA 的相對(duì) 表達(dá)量，與control 組相比，cpf0.6組（P＜0.05）與cpf1.2組（P＜0.01）COX2 mRNA 的表達(dá)均升高；與cpf0組相比，僅cpf1.2組COX2 mRNA 的表達(dá)升高（P＜0.05）；給藥組組間相比，cpf1.2組的COX2 mRNA 的表達(dá)明顯高于cpf0.3組和cpf0.6組（P＜0.05）。子代小鼠海馬組織CREB mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，與control 組相比，cpf0.3組（P＜0.05）、cpf0.6組（P＜0.01）與cpf1.2組（P＜0.01）CREB mRNA 的表達(dá)均顯著降低；與cpf0組相比，cpf0.6組（P＜0.05）與cpf1.2組（P＜0.01）CREB mRNA 的表達(dá)呈明顯降低趨勢(shì)；給藥組組間相比，cpf0.6組CREB mRNA 的表達(dá)與cpf0.3組和cpf1.2組相比，均有顯著性差異（P＜0.05）。子代小鼠海馬組織BDNF mRNA的相對(duì)表達(dá)量，與control 組和cpf0組相比，cpf0.3組和cpf0.6組的BDNF mRNA 的表達(dá)降低均較顯著（P＜0.05）；與control 組和cpf0組相比，cpf1.2組的BDNF mRNA 的表達(dá)的降低極顯著性差異（P＜0.01），且cpf1.2組的BDNF mRNA 表達(dá)明顯低于cpf0.3組（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)Fig.1。

2.3 子代小鼠海馬組織中COX2、CREB 及BDNF 蛋白的表達(dá)

母源CPF 暴露后，子代小鼠海馬組織中COX2 蛋白相對(duì)表達(dá)量，與control 組和cpf0組相比，各給藥組COX2 蛋白表達(dá)量均顯著升高（P＜0.01），給藥組間相比，cpf0.6組COX2 蛋白表達(dá)量顯著高于cpf0.3組（P＜0.01），cpf1.2組COX2 蛋白表達(dá)量顯著高于cpf0.3組與cpf0.6組（P＜0.01）。子代小鼠海馬組織中CREB 蛋白相對(duì)表達(dá)量，與control 組和cpf0組相比，隨著給藥劑量升高而顯著降低（P＜0.01），cpf1.2組與其他兩個(gè)給藥組相比蛋白表達(dá)量均顯著降低（P＜0.01），cpf0.6組CREB 蛋白表達(dá)量顯著低于cpf0.3組（P＜0.05）。子代小鼠海馬組織中BDNF 蛋白相對(duì)表達(dá)量，與control 組和cpf0相比，cpf0.6組和cpf1.2組BDNF 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），給藥組間相比，BDNF 蛋白的表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)Fig.2。

3 討論

CPF 進(jìn)入機(jī)體后，能夠在機(jī)體內(nèi)蓄積和代謝。Fenske［7］等對(duì)野外工作人員的CPF 暴露情況進(jìn)行了研究，結(jié)果在其尿液中檢測(cè)出含有CPF 的代謝產(chǎn)物3，5，6-三 氯-2-吡啶酚（3，5，6-trichloro-2-pyridylphenol，TCP），若長(zhǎng)期接觸下去，必定會(huì)影響機(jī)體的健康，導(dǎo)致出現(xiàn)某些健康風(fēng)險(xiǎn)。CPF 可通過(guò)抑制乙酰膽堿酯酶的活性造成神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用，這主要是在CPF 的作用下，體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶發(fā)生磷酸化，因此乙酰膽堿不能再被其水解，最終引起神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿的積累，使神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用。然而，在沒(méi)有乙酰膽堿酯酶抑制作用的情況下，動(dòng)物體仍能表現(xiàn)出神經(jīng)行為異常現(xiàn)象［8］。

COX2 信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期抗抑郁治療后能夠加強(qiáng)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）下游通路水平，增強(qiáng)蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）酶活性，使CREB 基因表達(dá)升高［9］。BDNF 在維持神經(jīng)細(xì)胞功能方面有重要作用，研究通過(guò)上調(diào)BDNF 的表達(dá)水平能夠提高小鼠的認(rèn)知功能［10］，長(zhǎng)期給予BDNF能夠使動(dòng)物產(chǎn)生抗抑郁樣狀態(tài)［11］，并且長(zhǎng)期進(jìn)行抗抑郁治療也能夠增加神經(jīng)系統(tǒng)的BDNF 水平［12］。CREB與BDNF 表達(dá)的增加出現(xiàn)在同一細(xì)胞層，并且時(shí)間相近，注入抗CREB 抗體還能夠降低BDNF 表達(dá)水平，提示CREB 也能夠調(diào)節(jié)BDNF 的表達(dá)［13］。

Fig.1 Expression of COX2、CREB and BDNF mRNA in hippocampus cortex of offspring in different groups（n=8）

Fig.2 Expression of COX2、CREB and BDNF protein in hippocampus cortex of offspring in different groups（n=8）

Fig.2 （continued）

COX2 是介導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵酶。在炎癥細(xì)胞因子和絲裂原的刺激下，COX2 能催化花生四烯酸（arachidonic acid，AA）生成相應(yīng)的前列腺素（prostaglandin，PGs），這些前列腺素主要是PGE2，通過(guò)相應(yīng)的G 蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而引起炎癥和組織損傷。PGE2通過(guò)與不同的PGE2受體結(jié)合，調(diào)節(jié)cAMP 的生成，使cAMP 通路下游部分CREB和BDNF 表達(dá)降低［14］。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)母代小鼠進(jìn)行CPF 灌胃處理至仔鼠斷奶，采集樣本，應(yīng)用熒光定量PCR 及Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，COX2 基因與蛋白表達(dá)增加的同時(shí)，CREB 與BDNF 表達(dá)均是降低的，表明CPF 能夠通過(guò)母源暴露作用于子代，進(jìn)而作用于COX2-CREB-BDNF 信號(hào)通路，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起代謝通路發(fā)生改變，使神經(jīng)興奮性降低，從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。