彭艷芳，張瑩雯，趙映前，王秀萍，艾 望

（1.武漢大學中南醫(yī)院，武漢 430071；2湖北中醫(yī)藥大學，武漢 430065；3.武漢大學，武漢 400071）

肺纖維化是由多原因引起的以炎性細胞浸潤、纖維母細胞增生、膠原纖維的沉積為特征的免疫介導的慢性炎性反應(yīng)性疾病[1-3]。其5年生存率為30%～50%，平均生存期不足3年[4-5]。免疫炎癥反應(yīng)是肺纖維化的早期的主病理機制，現(xiàn)代醫(yī)學對本病尚缺乏理想有效的藥物，大量學者認為應(yīng)用激素和（或）免疫抑制劑/細胞毒性藥物可以控制肺纖維化的發(fā)展，20世紀50年代糖皮質(zhì)激素、免抑制劑/細胞毒性被列為首選藥物[6]。但長期使用其療效局限且藥物不良反應(yīng)大如骨質(zhì)疏松、免疫功能低下、感染不愈合等[7]。而其最有效的治療方法是長期氧療和肺移植，但由于各種原因，肺移植在國內(nèi)的開展非常有限。因此，尋找PF新的治療手段成為目前研究的熱點與難點。紫檀芪（Pterostilbene）是從中藥紫檀、血竭、蜂膠中分離得到的一個反式二苯乙烯類化合物，現(xiàn)代大量的研究證實紫檀芪具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗衰老、肝腎保護以及抗病原微生物等多種藥理作用。目前發(fā)現(xiàn)紫檀芪還可以干預(yù)多種器官組織的纖維化過程，例如有報道紫檀芪可減輕二甲基亞硝胺所誘導大鼠產(chǎn)生肝臟纖維化[8]，這可能與其抑制TGF-β1/Smads信號通路有關(guān)。器官纖維化病理過程大都是纖維組織增生，細胞外基質(zhì)（ECM）沉積所致，紫檀芪能否在肺纖維化中也起到作用，國內(nèi)外未見報道，而筆者預(yù)實驗已提示紫檀芪可改善肺纖維化。因此本研究擬采用博萊霉素復制肺纖維化大鼠模型，觀察紫檀芪的抗肺纖維化作用及對肺纖維化大鼠NF-κB/TGF-β1/smad信號通路的影響，進一步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠（SPF級）50只，由武漢大學動物實驗部購進，6～8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；動物許可證號SCXK（京）2016-0006。實驗室人工光照、陰暗各 12 h（暗期 20：00-8：00），45%左右相對濕度，25℃恒溫的普通設(shè)施中，進行適應(yīng)性飼養(yǎng)。本實驗方案已通過武漢大學的實驗動物倫理委員會審查批準，批準編號：02517121A。

1.2 受試藥物 紫檀芪：日本富士株式會社，98%，HPLC；對照藥物：潑尼松片：5 mg/片 （生產(chǎn)批號：170545，國藥準字：H33021207，浙江仙居制藥股份有限公司生產(chǎn)）。潑尼松片置乳缽內(nèi)研碎加生理鹽水制成0.6 g/L混懸液，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與主要儀器 注射用鹽酸博來霉素：日本化藥株式會社生產(chǎn)，批號H20055883，15 mg/支；酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒NF-κB、TGF-β1，購自伊萊瑞特生物工程有限公司；免疫組化試劑盒購自武漢拜意爾生物有限公司。高速冷凍離心機：湖南湘儀儀器。DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠。蘇木素染液：武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司。MicroPublisher成像系統(tǒng)：Q-IMAGING公司。

2 方法

2.1 PF模型的制備、分組實驗前將所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，參照Szapie[9]等經(jīng)典造模方法誘導PF大鼠模型：各組大鼠稱量體質(zhì)量后，用1%戊巴比妥鈉溶液按40 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，然后將大鼠仰臥固定于鼠臺上，用絡(luò)合碘將鼠頸部皮膚消毒后逐層分離至暴露氣管后，用1 mL注射器經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端穿刺，一次性氣管內(nèi)滴入博萊霉素生理鹽水溶液0.2～0.3 mL（參考劑量為5 mg/kg）復制肺纖維化模型，空白組以相同方法滴入等體積生理鹽水，注射完畢后立即將大鼠直立旋轉(zhuǎn)30 s，盡量使藥液向下流入肺內(nèi)時能夠均勻分布，然后切口局部縫合，手術(shù)過程嚴格無菌操作。在實驗過程中各組大鼠自由進食和飲水。造模后當日將大鼠隨機分為模型組（B組）及潑尼松組（C組）、紫檀芪低劑量組（D組）、紫檀芪高劑量（E組），以SD大鼠設(shè)為正常組（A組），每組10只。

2.2 干預(yù)方法 于造模24 h后開始進行灌胃給藥，空白組和模型組生理鹽水灌胃10 mL/（kg·d），潑尼松組予以潑尼松混懸液3.0 mg/（kg.d），紫檀芪低、高劑量組分別以15 mg/（kg·d）、30 mg/（kg·d）給藥。各組大鼠每日灌胃1次，連續(xù)4周。

2.3 觀察指標及標本留取 各亞組大鼠均于給藥后第28天，用1%戊巴比妥鈉溶液按40 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，摘眼球取血3 mL，脫頸處死。大鼠處死后打開胸腔，結(jié)扎左肺門，分離氣管和肺組織，避免損傷肺組織，盡量剔除結(jié)締組織及周圍脂肪，冰生理鹽水沖洗后予以濾紙吸干，稱量肺濕重并記錄，計算肺指數(shù)；取肺組織完全浸泡于福爾馬林溶液中固定，分別行HE染色和石蠟包埋備做病理切片，同時進行免疫組化染色。

2.3.1 肺組織病理學觀察 HE染色觀察各組大鼠肺組織形態(tài)學的變化；病理學評分標準：參照Szapiel等[9]的方法對肺組織的肺泡炎及肺纖維化程度進行評分。

2.3.2 ELISA法檢測血清NF-κB、TGF-β1的水平 各亞組大鼠摘除眼球取血備用，收集血液樣本待血液凝固后，4℃2 000 g×10 min離心，收集上清，-20℃或更低溫度保存?zhèn)溆?，用于大鼠血清中NF-κB、TGF-β1的測定，測定方法嚴格按試劑盒說明書進行。

2.3.3 免疫組化檢測大鼠肺組織TGF-β1、Smad3的表達 石蠟切片脫蠟水化，PBS液浸泡，一抗孵育過夜，PBS沖洗，標記二抗，緩沖液沖洗后DAB顯色，自來水充分沖洗，復染，脫水，透明干燥，封片。胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。使用全自動計算機圖像分析系統(tǒng)Image Pro-Plus6.0對免疫組化染色結(jié)果進行半定量分析，計算積分光密度值（IOD）。每張免疫組化切片均采取400倍視野下觀察并采集圖像，隨機選擇5個視野進行采圖，測定其陽性染色的IOD值，以其均值反映表達量。

2.3.4 統(tǒng)計學處理 采用采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多樣本間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較在方差齊時采用LSD法，方差不齊時用Duunett’s T3法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 病理改變

3.1.1 肺大體肉眼觀察 正常組雙肺呈粉紅色，表面光滑，彈性良好。模型組雙肺呈灰白色，體積縮小，表面可見出血點和壞死灶，質(zhì)地較硬，彈性差。紫檀芪組和潑尼松組肺組織較模型組顏色稍紅，彈性較模型組軟，肺表面出血點、壞死灶較少，見圖1。

3.1.2 鏡下病理改變 從大鼠肺組織HE染色結(jié)果分析，空白組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁未見增厚，偶見炎性細胞，無間質(zhì)纖維組織增生；模型組的肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，有大量纖維組織增生及膠原沉積，炎性細胞浸潤，融合成片，纖維化明顯。紫檀芪組、強的松組肺泡炎及纖維化程度均較模型組輕，肺泡間隔增厚程度相對較輕，病變范圍局限，其中紫檀芪高劑量組改善更明顯，見圖2。

3.2 各組大鼠血清中TGF-β1、NF-κB水平的比較與空白組比較，其他組血清中TGF-β1、NF-κB含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，潑尼松組和紫檀芪組均降低大鼠血清中 TGF-β1、NF-κB 含量（P＜0.01）；與潑尼松組相比，紫檀芪高劑量組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)果見表 1。

3.3 免疫組化檢測肺組織TGF-β1、Smad3的表達情況

3.3.1 各組大鼠肺組織TGF-β1的免疫染色比較 大鼠肺組織中TGF-β1蛋白表達主要位于肺泡巨噬細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞及成纖維細胞等細胞質(zhì)中，呈黃色或棕黃色顆粒。空白組大鼠呈弱陽性表達，模型組大鼠肺組織TGF-β1含量較空白組明顯增高，有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，紫檀芪各組肺組織TGF-β1表達在均有降低，且有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與潑尼松對照組相比，紫檀芪高劑量組出現(xiàn)肺內(nèi)TGF-β1下降（P＜0.01）。見圖 3、表 2。

3.3.2 各組大鼠肺組織Smad3的免疫染色比較 免疫組化染色顯示：正常組大鼠肺組織中僅有少數(shù)細胞胞漿被染成淺黃色，強度較弱，主要在肺泡巨噬細胞及支氣管上皮細胞分布，而模型組大鼠肺組織細胞的陽性表達呈棕黃色，較對照組染色增強，陽性表達主要位于支氣管上皮細胞、肺泡巨噬細胞和肺泡上皮細胞的細胞核內(nèi)；潑尼松組、紫檀芪組各劑量組染色陽性細胞數(shù)量介于同期空白對照組與模型對照組之間。見圖4、表3。

由表3可知，與模型組相比，各給藥組大鼠肺組織Smad3的表達均有下降，差異顯著（P＜0.01）；與潑尼松對照組相比，紫檀芪高劑量組出現(xiàn)肺內(nèi)Smad3的低表達狀態(tài)（P＜0.05）。

圖1 肺組織大體觀察圖

圖2 第28天各組大鼠肺組織HE染色觀察（HE染色，200×）

圖3 第28天各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達（免疫組化，400×）

4 討論

肺纖維化是一種常見的纖維増生性疾病，呈進行性發(fā)展，是呼吸系統(tǒng)最嚴重的慢性疾病之一，目前公認的觀點為肺纖維化是一種多因素多途徑共同作用的疾病。上皮細胞在外在的環(huán)境和內(nèi)在的基因等多因素作用下，會發(fā)生損傷，損傷后炎癥反應(yīng)被激活，細胞信號等多重途徑得到啟動，多個信號途徑導致了肺內(nèi)促纖維化及抗纖維化因子的失衡，而活化的因子反過來又激活多種細胞，導致細胞大量表達炎癥介質(zhì)和細胞因子，在細胞因子介導的多信號通路，細胞間相互發(fā)生作用，從而最終導致肺纖維化的形成[10]。在多種引起肺纖維化的細胞因子中，TGF-β1是最重要的調(diào)控因子[11]。一方面TGF-β1可促進肺成纖維細胞異常增殖，刺激成纖維細胞合成細胞外基質(zhì)，使細胞外基質(zhì)在肺間質(zhì)和肺泡間過度積聚。另一方面，TGF-β1可誘導蛋白酶抑制劑的表達，最終導致基質(zhì)的異常積聚和纖維形成[12]。因此，通過影響TGF-β1的合成或阻斷其信號轉(zhuǎn)導通路來抑制纖維化的進程，成為肺纖維化治療的研究熱點。

圖4 第28天各組大鼠肺組織Smad3蛋白表達（免疫組化，400×）

表 1 各組大鼠血清中 TGF-β1、NF-κB 的比較（s）pg/mL

表 1 各組大鼠血清中 TGF-β1、NF-κB 的比較（s）pg/mL

注：與空白組比較，*P＜0.01，與模型組比較，#P＜0.01；與潑尼松組比較，△P＜0.01。

?

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1的表達（，IOD值）

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1的表達（，IOD值）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與潑尼松組比較△P＜0.01，△△P＜0.05。

?

表3 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3的表達（，IOD 值）

表3 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3的表達（，IOD 值）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較#P＜0.01；與潑尼松組比較△P＜0.01，△△P＜0.05。

?

有學者證明在肺纖維化疾病中NF-κB、TGF-β的活性和（或）量是明顯增加的，而通過抑制NF-κB和（或）抑制TGF-β的產(chǎn)生能夠明顯的減輕肺部纖維化的發(fā)生發(fā)展[13-14]，提示 NF-κB、TGF-β 的含量及活性與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關(guān)系。NF-κB通過對肺泡巨噬細胞、TGF-β等多種細胞因子過度表達，介導肺泡炎和肺纖維化進程[15]。肺泡炎是發(fā)生肺間質(zhì)纖維化的中心環(huán)節(jié)，NF-κB被激活又是發(fā)生炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，NF-κB是TGF-β1表達的上游調(diào)節(jié)基因，NF-κB激活后與TGF-β1的啟動子結(jié)合，誘導TGF-β1的表達[16]，這點可以從模型組NF-κB高表達看出，同時伴有TGF-β1表達增高。因此干預(yù)TGF-β1、NF-κB被認為是抗肺纖維化藥物治療的關(guān)鍵分子靶點[17]。Qureshi等[18]發(fā)現(xiàn)，紫檀芪具有抑制核因子NF-κB活化的能力，從而抑制促炎性細胞因子和一氧化氮合酶基因的活化，導致腫瘤壞死因子α、白介素1β、白介素6分泌減少，從而減輕炎癥的刺激反應(yīng)。我們的實驗中也發(fā)現(xiàn)紫檀芪可降低血清中NF-κB，與報道相一致。Smad蛋白是TGF-β下游信號轉(zhuǎn)導和調(diào)節(jié)分子，參與TGF-β信號細胞內(nèi)傳導[19]。磷酸化的Smad2、3與Smad4形成Co-Smads進入細胞核調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，誘導肺組織纖維化改變[20]。TGF-β1可啟動和放大級聯(lián)瀑布式促纖維化效應(yīng)，Smad3是TGF-β1受體激活后的主要作用靶點，在TGF-β1介導的肺纖維化起著不可替代的作用[21]。Smad3參與了TGF-β1介導的多個促纖維化反應(yīng)過程，因此，以NF-κB/TGF-β1/Smad信號通路為作用靶點的治療手段將會成為肺纖維化的有效治療方案。本研究中，與模型組相比，各給藥組大鼠肺組織NF-κB/TGF-β1/Smad的表達在均有下降，差異顯著（P＜0.01）。

天然的植物活性成分用于各種慢性疾病的防治與治療已越來越受到關(guān)注，多酚類化合物紫檀芪（Pterostilbene）是一種天然的植物活性成分，且紫檀芪由于具有廣泛的藥理活性而備受重視。在自然界中，紫檀芪分布廣泛，由于最初在紫檀[22]中發(fā)現(xiàn)，故而命名為紫檀芪。后來，在藍莓（Vaccinium）、龍血竭（ChineseDragon’s Blood）、交趾黃檀（Dalbergiacochinchinensis）、苜蓿（Medicago sativa Linn）以及葡萄（Vitis spp.）中均有發(fā)現(xiàn)紫檀芪[23-28，29]。周艷林等[31]采用HPLC-DPPH法評價劍葉龍血樹中芪類化合物的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)其活性強弱依次為紫檀芪（73.19%，清除率，下同）＞白藜蘆醇（71.10%）＞龍血素B（39.01%）＞龍血素 A（12.14%）。該結(jié)果與Nichols等[30]的研究報道一致。紫檀芪是白藜蘆醇的一種衍生物，其化學結(jié)構(gòu)較白藜蘆醇多出兩個甲氧基，兩者具有相似的藥理特性。實驗表明，在同等情況下，紫檀芪比白藜蘆醇有更高的生物利用率和生物活性[31]。口服吸收度更好[32]。在紫檀芪的安全性方面，將紫檀芪以3 000 mg/（kg·d）的劑量作用于動物時未見明顯毒副作用[33]。因此，紫檀芪較白藜蘆醇可能更適于進一步開發(fā)并應(yīng)用于臨床。目前實驗及臨床已經(jīng)證實白藜蘆醇[34-35]能夠降低肺纖維化程度，故本課題選用紫檀芪來治療肺纖維化。本次實驗結(jié)果顯示模型組肺泡炎、肺纖維化程度明顯高于強的松組、紫檀芪組，提示紫檀芪可改善肺組織病理變化，延緩肺纖維化進展，而且紫檀芪高劑量組治療效果更好；紫檀芪能夠有效降低博萊霉素所致的肺纖維化大鼠血清、肺組織炎性指標NF-κB、TGF-β1、Smad3的濃度值，改善肺泡炎癥，進而抑制肺纖維化，這可能是紫檀芪防治肺纖維化的作用機制之一。本實驗是對紫檀芪治療肺纖維化的作用進行初步探索，有待于今后更進一步的研究。