袁冬寅，肖文軍,3，彭影琦，林玲，周陽，譚春波，譚洪波，龔志華*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 湖南武陵秀峰茶業(yè)有限公司，湖南 常德 415000；3. 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128

高尿酸血癥（hyperuricemic,HUA）是由嘌呤代謝絮亂導致機體尿酸水平超出正常范圍的一種生理現(xiàn)象[1]。機體內(nèi)尿酸生成增多和/或排泄減少是導致HUA的主要原因[2]，降低尿酸代謝過程中的關(guān)鍵酶活性是防治HUA重要的切入點。黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase,XOD）和腺苷脫氨酶（adenosine deaminase,ADA）是尿酸合成過程中的關(guān)鍵酶，可通過抑制其活性來降低體內(nèi)尿酸水平并達到緩解HUA的效果[3]。研究表明，HUA不僅是痛風的并發(fā)癥，而且還會引發(fā)高血壓、冠心病、糖尿病等[1,4]。

紅茶是六大茶類中的全發(fā)酵茶，含有茶黃素、茶紅素等品質(zhì)和功能成分，具有治療心腦血管疾病、降脂減肥、預防神經(jīng)退行性疾病等[5-9]的多種生物活性作用。朱創(chuàng)等[6]研究表明，紅茶提取物能抑制肝臟XOD活性，減少尿酸生產(chǎn)。隨著近年對茯磚茶在減肥、降血脂、抗氧化、抗腹瀉、保肝護肝等健康功能方面研究的深入[10-14]，在發(fā)現(xiàn)普洱熟茶具有降低高尿酸模型小鼠尿酸的作用之后，又發(fā)現(xiàn)金花散茶也能通過抑制肝臟XOD、ADA活性而減輕HUA的癥狀[15-16]。發(fā)花紅磚茶是在紅茶的基礎(chǔ)上增加了發(fā)花、壓制等工藝的一種紅茶新產(chǎn)品，是否比其紅茶具有更好的降尿酸作用尚有待進一步探究。本研究以相同鮮葉加工而成的紅茶及其發(fā)花紅磚茶為原料，以高尿酸血癥小鼠作為試驗對象，探究發(fā)花紅磚茶是否具有降尿酸作用，比較紅茶及其發(fā)花紅磚茶的降尿酸效果，為發(fā)花紅磚茶的生產(chǎn)與消費提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器設(shè)備

1.1.1 試驗動物

SPF級KM小鼠90只，雄性，(20±2)g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，試驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

1.1.2 材料

紅茶及發(fā)花紅磚茶均由湖南武陵秀峰茶業(yè)有限公司生產(chǎn)加工。紅茶是由碧香早一芽三四葉經(jīng)萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等工藝加工而成；發(fā)花紅磚茶是在紅茶的基礎(chǔ)增加了發(fā)花、壓制等工藝加工而成。

1.1.3 試劑

氧嗪酸鉀（PO）購于上海阿拉丁，純度≥98%；別嘌呤醇片購于上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購于國藥集團化學試劑有限公司；尿酸、尿素氮、肌酐、XOD、ADA試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.1.4 儀器設(shè)備

多功能酶標儀（賽默飛世爾上海儀器有限公司）、MIKRO22R 型臺式冷凍離心機（德國 Hettich 公司）、電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）、電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、冷凍干燥機（廣州三元科技有限公司）、PowerGen 125高速勻漿機（中國賽默飛世爾科技公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）、紫外分光光度計UV-2550（日本島津公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶樣前處理方法

稱取加工原料嫩度一致的紅茶和發(fā)花紅磚茶各600 g，分別粉碎后，按茶水比1∶10在沸水浴中提取 30 min，浸提 2次，過濾，合并濾液于55℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至固態(tài)物含量約30%后，冷凍干燥分別得干粉143.50 g與 147.70 g，鋁箔袋收集干粉，放入冰箱保存。經(jīng)檢測，紅茶干粉中茶多酚、咖啡堿、簡單兒茶素、酯型兒茶素、兒茶素總量、茶黃素、茶紅素、茶褐素含量分別為31.30%、10.24%、1.30%、1.69%、3.29%、1.55%、19.61%、22.67%。發(fā)花紅磚茶干粉中茶多酚、咖啡堿、簡單兒茶素、酯型兒茶素、兒茶素總量、茶黃素、茶紅素、茶褐素的含量分別為30.90%、11.44%、1.61%、1.19%、2.80%、1.22%、19.18%、29.70%。

1.2.2 HUA小鼠模型的方法建立

20只SPF級KM小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，稱重，隨機分為正常組（NC）、模型組（MC），每組10只。第8天上午，模型組灌喂250 mg·kg-1的PO（用0.50% CMC-Na溶液懸?。┻M行造模[15]，灌喂體積為每 10 g體質(zhì)量 0.1mL，正常組灌喂等體積的0.50% CMC-Na溶液，連續(xù)7 d，并在第14天灌喂處理1 h后，2組小鼠注射2%戊巴比妥鈉麻醉，摘眼球取血，每組采血時間不超過5 min。血液室溫靜置、離心取血清檢測血尿酸（SUA）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）。根據(jù)文獻[6]，當模型組SUA水平顯著高于空白組時，說明造模成功，當BUN和/或SCr水平顯著高于空白組時，說明PO可能對腎臟造成損傷，并由此來建立HUA小鼠模型的方法。

1.2.3 動物試驗設(shè)計

以建立的HUA小鼠模型方法為基礎(chǔ)，將90只 SPF級 KM小鼠在 22～25℃條件下適應(yīng)性飼養(yǎng) 7 d后，稱體質(zhì)量，隨機分為正常組（NC）、模型組（MC）、紅茶高劑量組（BH）、紅茶中劑量組（BM）、紅茶低劑量組（BL）、發(fā)花紅磚茶高劑量組（FBH）、發(fā)花紅磚茶中劑量組（FBM）、發(fā)花紅磚茶低劑量組（FBL）、別嘌呤醇組（AP），每組10只。按參考文獻[15,17]，確定別嘌呤醇劑量為 20 mg·kg-1·d-1，按1.2.1處理所得的茶粉高、中、低劑量分別為 2 g·kg-1·d-1、1 g·kg-1·d-1、0.50 g·kg-1·d-1。第8天至第14天期間，除正常組之外，其余各組按1.2.2所述方法每天定時灌喂PO進行造模，同時正常組灌喂等體積的 0.50%CMC-Na溶液。第15天至第28天期間，在正常組與其余各組分別灌喂等體積的 0.50%CMC-Na和PO 1 h后，別嘌呤醇組與給茶組分別灌喂相應(yīng)劑量的別嘌呤醇和茶水提取物（均溶解于6 mL水中），正常組與模型組均灌喂等體積的水，灌喂體積為每 10 g體質(zhì)量0.1 mL；第26天，用代謝籠收集24 h的尿液；第28天，各組灌喂給藥1 h后，每只小鼠注射2%戊巴比妥鈉麻醉，摘眼球取血，每組采血時間不超過5 min，并解剖肝臟、腎臟組織。

1.3 檢測方法

1.3.1 小鼠體質(zhì)量與器官指數(shù)測定

每天稱每組小鼠總體質(zhì)量，隔日稱每只小鼠體質(zhì)量。

將小鼠肝臟與腎臟于 4℃的生理鹽水洗凈血漬，濾紙吸干表面水分后稱其濕重。

器官指數(shù)（%）=器官質(zhì)量（g）/小鼠體質(zhì)量（g）×100%。

1.3.2 血尿酸、血尿素氮、血肌酐含量測定

采血后室溫靜置1 h，4℃下3 000 r·min-1離心 10 min，取血清，按試劑盒測定 SUA、BUN、SCr含量。

1.3.3 尿尿酸、尿尿素氮、尿肌酐含量測定

新鮮尿液以 3 000 r·min-1離心 15 min，去沉渣，取上清液，按試劑盒測定UUA、UUN、UCr含量。

1.3.4 肝臟組織中XOD和ADA活性測定

將肝臟組織按質(zhì)量（g）在預冷的生理鹽水體積（mL）為1∶9比例下，在冰水浴中混合，再用組織勻漿機制成 10%勻漿，2 500 r·min-1離心10 min，小心除去脂質(zhì)層，取上清液按試劑盒測定XOD及ADA活性。

1.3.5 茶粉品質(zhì)成分檢測

茶多酚總量的檢測采用 GB/T 8313—2008方法；咖啡堿、兒茶素的含量檢測采用HPLC法[15]；茶黃素、茶紅素、茶褐素的含量檢測采用紫外比色法[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差（±s）表示，采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析；二組間的差異采用t檢測，多組間比較用單因素方差分析，考察各組間的統(tǒng)計學差異；P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 HUA小鼠模型方法的建立

血肌酐水平是評價機體腎功能的重要指標，腎功能損傷導致肌酐排泄障礙，從而引起機體肌酐水平的升高。表1表明，與正常組相比，小鼠連續(xù)7 d灌喂250 mg·kg-1PO進行造模后，盡管模型組與正常組的BUN水平無顯著性差異（P＞0.05），但 SUA、SCr水平顯著升高（P＜0.05），其中SUA比正常組升高了52.30%，說明造模成功。

2.2 紅茶及其發(fā)花紅磚茶對 HUA模型小鼠的降尿酸作用

2.2.1 對體質(zhì)量與器官指數(shù)的影響

由表 2可知，整個試驗過程中，各組小鼠體質(zhì)量均有所增加。正常組與模型組相比，體質(zhì)量增加量無顯著差異，說明灌喂 PO未對體質(zhì)量造成影響。8～20 d給藥期間，與模型組相比，給茶組體質(zhì)量均顯著降低（P＜0.05），這可能與紅茶、發(fā)花紅磚茶具有降脂減肥作用有關(guān)。

表3顯示，與正常組相比，模型組肝臟、腎臟指數(shù)均有所上升，其中肝臟指數(shù)達顯著水平（P＜0.05）。與模型組相比，給茶組肝臟、腎臟指數(shù)均降低，其中除紅茶低劑量組之外，其他給茶組的腎臟指數(shù)達顯著水平（P＜0.05），同時兩種茶對應(yīng)劑量組之間均無顯著差異。與別嘌呤醇組相比，除紅茶低劑量組之外，其他給茶組的腎臟指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。說明紅茶及其發(fā)花紅磚茶具有降低HUA小鼠肝臟、腎臟指數(shù)的作用。

2.2.2 對小鼠血尿酸、血尿素氮和血肌酐的影響

圖1表明，與正常組相比，模型組小鼠的SUA、BUN、SCr水平均極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，別嘌呤醇組的 SUA、BUN、SCr水平顯著降低（P＜0.05），其中SUA、SCr達極顯著水平（P＜0.01）。灌喂二種茶均能降低HUA小鼠SUA、BUN、SCr水平，其中，發(fā)花紅磚茶中、高劑量組在降低 SUA的效果上比紅茶更好。與模型組相比，紅茶低、中、高劑量組的SUA水平分別降低13.69%、16.58%、17.92%（P＜0.05），發(fā)花紅磚茶低、中、高劑量組的SUA水平分別降低14.67%（P＜0.05）、24.44%（P＜0.01）、26.43%（P＜0.01）；同時二種茶均能極顯著降低 BUN、SCr水平（P＜0.01），且均優(yōu)于別嘌呤醇組；發(fā)花紅磚茶低劑量組在降低BUN的效果上比紅茶更好，而二種茶在降低SCr方面則無顯著差異。由此提示紅茶和發(fā)花紅磚茶均具有保護HUA小鼠腎臟的作用。

表1 灌喂氧嗪酸鉀對小鼠SUA、BUN及SCr水平的影響Table 1 Effects of potassium oxonate on serum uric acid,BUN and serum creatinine levels in mice

表2 紅茶及其發(fā)花紅磚茶對HUA小鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Effects of black tea and its flower brick tea on the weight changes of hyperuricemic mice

表3 紅茶及其發(fā)花紅磚茶對HUA小鼠器官指數(shù)的影響Table 3 Effects of black tea and its flower brick tea on organs index of hyperuricemic mice

2.2.3 對小鼠尿尿酸、尿尿素氮和尿肌酐的影響

從圖2可以看出，與正常組比較，模型組的 UUA、UUN、UCr水平均極顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，別嘌呤醇組的UUA、UUN、UCr均極顯著升高（P＜0.01），紅茶及發(fā)花紅磚茶各劑量組的 UUA、UUN、UCr水平均不同程度升高，其中高劑量組的 UUA以及中、高劑量組的 UUN、UCr達極顯著水平（P＜0.01），此外，紅茶中劑量組的UUA以及低劑量組的UCr達顯著水平（P＜0.05），發(fā)花紅磚茶低劑量組的UCr達極顯著水平（P＜0.01）。與紅茶各劑量組相比，發(fā)花紅磚茶高劑量組在升高UUA、UUN、UCr的水平上以及中、低劑量組分別在升高UUN與UCr水平上優(yōu)于紅茶。與別嘌呤醇組相比，二種茶中劑量組及發(fā)花紅磚茶高劑量組、二種茶高劑量組分別在升高 UUN、UCr水平方面作用效果優(yōu)于別嘌呤醇組。

圖1 紅茶及其發(fā)花紅磚茶對HUA小鼠SUA、BUN和SCr水平的影響Fig. 1 Effects of black tea and its flower brick tea on serum uric acid,BUN,serum creatinine levels in hyperuricemic mice

2.2.4 對小鼠肝臟組織 XOD和 ADA活性的影響

圖 3表明，模型組小鼠肝臟組織中的XOD、ADA活性與正常組相比，均極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，別嘌呤醇組的 XOD、ADA活性分別降低了 23.13%、18.96%，差異均達極顯著水平（P＜0.01）；紅茶及發(fā)花紅磚茶各劑量組的XOD、ADA活性均不同程度降低，其中，中、高劑量組達顯著水平（P＜0.05），發(fā)花紅磚茶高劑量及紅茶中、高劑量達極顯著水平（P＜0.01），同時二種茶對應(yīng)劑量組之間無顯著差異。

圖2 紅茶及其發(fā)花紅磚茶對HUA小鼠尿尿酸、尿尿素氮、尿肌酐水平的影響Fig. 2 Effects of black tea and its flower brick tea on urine uric acid,urine urea nitrogen and urine creatinine levels in hyperuricemic mice

圖3 紅茶及其發(fā)花紅磚茶對HUA小鼠肝臟組織XOD和ADA活性的影響Fig. 3 Effects of black tea and its flower brick tea on XOD and ADA activities in hyperuricemic mice

3 結(jié)論與討論

尿酸是由嘌呤核苷在嘌呤核苷磷酸化酶、XOD等作用下產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，大多可通過肝臟尿素酶作用降解為尿囊素隨尿液排出。正常情況下，機體中的尿酸生成與排泄基本保持動態(tài)平衡，但當血尿酸產(chǎn)生過多和（或）分泌過少均可引發(fā)高尿酸血癥[19-20]。PO是一種尿酸酶抑制劑，可特異性阻斷尿酸降解為尿囊素，從而提高血尿酸水平。因此，在高尿酸血癥的試驗研究中PO已被廣泛應(yīng)用于高尿酸血癥的造模[16]。

試驗結(jié)果顯示，與模型組相比，紅茶及其發(fā)花紅磚茶各劑量組的體質(zhì)量增加量、腎臟指數(shù)及SUA水平均顯著降低，UUA水平則不同程度升高，且對SUA、UUA的作用效果具有劑量效應(yīng)；同時二種茶均能極顯著降低血清中尿素氮、肌酐水平，作用效果優(yōu)于別嘌呤醇，還提高尿液中尿素氮、肌酐水平，說明紅茶及其發(fā)花紅磚茶均對腎臟具有保護作用。這可能與二種茶含有一定量的茶多酚、咖啡堿、茶黃素等活性較強的物質(zhì)有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚中EC、EGC、ECG對高尿酸血癥小鼠具有降尿酸作用，而 EGCG對高尿酸血癥小鼠無顯著降尿酸作用[21]。本試驗發(fā)現(xiàn)，與紅茶各劑量組相比，發(fā)花紅磚茶高劑量組在降低血尿酸、提高尿尿酸、尿尿素氮、尿肌酐水平等方面均優(yōu)于紅茶。這可能是發(fā)花紅磚茶在發(fā)花工藝過程由于冠突散囊菌等微生物的參與而使像酯型兒茶素EGCG這類物質(zhì)部分發(fā)生水解，轉(zhuǎn)變成簡單兒茶素和沒食子酸，為其降尿酸奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)[22]，也有可能是在后發(fā)酵過程中由兒茶素、茶黃素或茶紅素進一步氧化聚合所致。

XOD是尿酸生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵酶，是抗高尿酸血癥藥的良好靶點，能催化黃嘌呤和次黃嘌呤生成尿酸和超氧離子，XOD活性或濃度增加是尿酸生成增多的主要原因[2]。ADA在嘌呤代謝和腺苷平衡中起重要作用，能催化2-脫氧腺苷和腺苷水解脫氨，腺嘌呤核苷脫氨轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤核苷，間接影響尿酸的生成[23]。PO誘導的 HUA小鼠會導致體內(nèi)抗氧化能力明顯減弱，過高尿酸水平會造成細胞膜內(nèi)外滲透壓不平衡，引起多種酶活性發(fā)生改變。本試驗發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，給茶組均能不同程度降低XOD、ADA活性，減少尿酸的產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)，酚類和黃酮類等物質(zhì)能抑制XOD活性。因為這些活性物質(zhì)含有酚羥基結(jié)構(gòu)，具有較強的抗氧化、清除氧自由基的作用，而且茶多酚還能降低細胞質(zhì)膜被氧化，保護組織免受過氧化的破壞。因此推測紅茶及其發(fā)花紅磚茶能抑制XOD活性與這二種茶含有一定量的酚類和黃酮類物質(zhì)有關(guān)[15,21,24-25]。但是，目前對抑制ADA活性物質(zhì)基礎(chǔ)的研究較少，還不能進一步解釋這二種抑制ADA活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，本試驗發(fā)現(xiàn)與模型組相比，給茶組的體質(zhì)量增加量均出現(xiàn)降低的現(xiàn)象。這可能與紅茶中咖啡堿、兒茶素及其氧化成分等物質(zhì)具有降脂減肥功效有關(guān)。由于高尿酸血癥與其他代謝綜合征的相互關(guān)系，因此推測，這二種茶在降脂減肥的同時還會導致尿酸水平的降低。同時研究發(fā)現(xiàn)，紅茶、發(fā)花紅磚茶對肝臟組織中XOD、ADA活性的抑制水平與其降低血液、尿液中的尿酸水平并未表現(xiàn)出完全一致的對應(yīng)關(guān)系，可能與尿酸的產(chǎn)生除受XOD、ADA影響外還受其他因素影響所致，或者是這二種茶還參與其他機制調(diào)控著尿酸水平，但其機制尚需進一步探究。