王 瑞，董 榮，喬 丹，李 倩，張 軻，張珍珍

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052)

新疆光熱資源豐富，晝夜溫差大，十分適宜釀酒葡萄的生長(zhǎng)，新疆與美國(guó)加州和法國(guó)波爾多并稱為“世界上適宜葡萄栽培的三大黃金地區(qū)”，新疆的葡萄酒產(chǎn)業(yè)現(xiàn)已成為十分具有發(fā)展?jié)摿Φ某?yáng)產(chǎn)業(yè)[1]。葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生甲醇、生物胺、雜醇油等發(fā)酵副產(chǎn)物，而這些發(fā)酵副產(chǎn)物會(huì)嚴(yán)重影響葡萄酒的品質(zhì)和質(zhì)量安全，危害人體健康[2-3]。生物胺是氨基酸脫羧或醛類物質(zhì)由氨基酸轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)氨作用而形成，其廣泛存在于發(fā)酵食品中[4]。雖然生物胺在人體代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，但它同時(shí)也會(huì)引起頭痛、心悸等過(guò)敏反應(yīng)[5-6]。生物胺在人體細(xì)胞中會(huì)被某些酶促代謝降解，但酒精會(huì)抑制這些酶的活性，使得脫毒效率降低。其中，組胺和酪胺被認(rèn)為是對(duì)人體危害最大的生物胺，一些國(guó)家已經(jīng)對(duì)葡萄酒中組胺含量做出了限定標(biāo)準(zhǔn)[7-9]，例如：澳大利亞、瑞士限量范圍為≤10 mg/L，比利時(shí)為≤5～6 mg/L，法國(guó)為≤8 mg/L。腐胺和尸胺等雖然不能直接導(dǎo)致中毒，但它們能與其余幾種生物胺協(xié)同作用，增強(qiáng)中毒癥狀。目前，生物胺的檢測(cè)方法有多種多樣，主要有生物傳感器、毛細(xì)管電泳、薄層色譜以及高效液相色譜法等[10]。本實(shí)驗(yàn)以新疆地產(chǎn)的釀酒葡萄為試材，以釀造過(guò)程工藝參數(shù)為切入點(diǎn)，分析在葡萄酒釀造、貯存過(guò)程中各因素對(duì)生物胺產(chǎn)生積累的影響，闡明葡萄酒生產(chǎn)及貯存過(guò)程中生物胺形成的關(guān)鍵控制點(diǎn)。為控制新疆地產(chǎn)葡萄酒中生物胺的含量，消除葡萄酒潛在安全隱患，促進(jìn)新疆傳統(tǒng)葡萄酒行業(yè)得到健康發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2017年新疆瑪納斯地產(chǎn)赤霞珠葡萄(Cabernet Sauvignon)；丙酮、甲醇、色胺、苯乙胺、酪胺、組胺、腐胺、尸胺、亞精胺、精胺、丹磺酰氯（均為色譜純），美國(guó)Sigma公司；氯化鈉、乙醚、氯仿、正丁醇（均為分析純），南京化學(xué)試劑股份有限公司；酵母Ⅰ（L2323）、酵母Ⅱ（B0213）、酵母Ⅲ（RC212），乳酸菌Ⅰ、乳酸菌Ⅱ、乳酸菌Ⅲ，法國(guó)Lallemand公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200 Series高效液相色譜儀（high performance liquid chromatograph，HPLC），美國(guó) Agilent公司；CT-6020A酸度計(jì)，深圳市柯迪達(dá)電子有限公司；PL303電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；D2155W離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；HS120210漩渦儀，美國(guó)Heathrow Vortexer公司；0.22 μm孔徑有機(jī)相濾膜，上海安普科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄酒傳統(tǒng)釀造工藝流程

原料→分選→除梗破碎→添加SO2→活化酵母→添加酵母→22～25℃酒精發(fā)酵→皮渣分離→10 d后澄清→取樣→-40℃冷藏

1.3.2 樣品前處理

向10 mL的葡萄酒樣品中添加NaCl至飽和，待樣品飽和后，取上清液5 mL置于離心管中。將其pH值調(diào)節(jié)為12后，加入5 mL正丁醇∶氯仿（1∶1，v/v）萃取并振蕩，在3600 r/min的條件下離心10 min，吸取上層清液。重復(fù)萃取過(guò)程2次后量取3 mL萃取液，加入0.3 mL HCl（1 mol/L），振蕩混合后氮?dú)獯蹈?，加? mL HCl（0.1 mol/L）溶解，樣品待衍生。

1.3.3 生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用0.1 mol/L的HCl將各生物胺標(biāo)準(zhǔn)品溶解，配制成濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，液體保存于4℃條件下。將8種生物胺單組分標(biāo)準(zhǔn)貯備液各取1 mL，共同置于10 mL的容量瓶中，用0.1 mol/L HCl定容，配成生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。最后分別移取0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.50 mL、5.00 mL上述溶液于10 mL容量瓶后定容，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/L、2.50 mg/L、5.00 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、25.0 mg/L、50.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的衍生

取上述生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，加入1 mL丹磺酰氯，1.5 mL飽和碳酸氫鈉，60℃下避光反應(yīng)30 min，再加入100 μL谷氨酸鈉溶液混合均勻，60℃條件下反應(yīng)15 min。反應(yīng)結(jié)束后，各加入1 mL超純水，混勻，40℃下氮?dú)獯等ケ?。最后加入乙醚進(jìn)行萃取，并重復(fù)萃取2次，合并乙醚萃取液，40℃條件下氮?dú)獯蹈珊?，? mL色譜純甲醇進(jìn)行溶解，后將試樣過(guò)0.22 μm濾膜，濾液待檢測(cè)。樣品衍生過(guò)程同上。

1.3.5 高效液相色譜條件

色譜條件：流動(dòng)相A為甲醇，B為超純水，梯度洗脫，C18色譜柱，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速1.5 mL/min，洗脫程序見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型及接種量酵母對(duì)葡萄酒中生物胺含量的影響（圖1）

在葡萄酒的釀造過(guò)程中酵母菌起著至關(guān)重要的作用，這其中不僅有野生酵母的參與，商業(yè)酵母更是廣泛應(yīng)用于釀造生產(chǎn)中[11]。本研究依照傳統(tǒng)釀造工藝，研究比較3種不同商業(yè)酵母及接種量對(duì)葡萄酒中生物胺含量的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，當(dāng)接種不同類型酵母時(shí)，葡萄酒中生物胺含量存在明顯差異，其中，當(dāng)接種酵母Ⅰ時(shí)，葡萄酒中尸胺和亞精胺含量顯著高于接種其他兩種酵母的葡萄酒，在1%水平下差異極顯著。而精胺、色胺和組胺含量則明顯低于接種酵母Ⅱ和酵母Ⅲ，說(shuō)明酵母對(duì)葡萄酒中生物胺的形成有一定的影響，且生物胺的形成較為復(fù)雜。當(dāng)酵母類型相同，接種量不同時(shí)，葡萄酒中的生物胺含量也有差異。酵母接種量為400 mg/L時(shí)，除苯乙胺外，生物胺含量略高于接種量為200 mg/L酵母，但差異較小。說(shuō)明酵母接種量對(duì)生物胺含量的影響小于酵母類型對(duì)生物胺含量的影響。

表1 梯度洗脫程序

圖1 接種不同類型及接種量的酵母對(duì)葡萄酒中生物胺含量的影響

2.2 不同的發(fā)酵溫度對(duì)葡萄酒中生物胺含量的影響（圖2）

發(fā)酵溫度影響著葡萄酒中微生物的生長(zhǎng)繁殖，本部分主要研究了當(dāng)發(fā)酵溫度分別為18℃、22℃和26℃時(shí)對(duì)葡萄酒中生物胺含量的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，葡萄酒中苯乙胺、色胺和精胺含量在發(fā)酵溫度為22℃時(shí)較高。而腐胺、尸胺、組胺、酪胺和亞精胺含量則隨著發(fā)酵溫度的升高而減少，且不同發(fā)酵溫度條件下，各生物胺含量在1%條件下差異不顯著，說(shuō)明葡萄酒釀造過(guò)程中發(fā)酵溫度對(duì)生物胺含量的影響較小，不是影響生物胺含量的關(guān)鍵因素。

圖2 不同的發(fā)酵溫度對(duì)葡萄酒中生物胺含量的影響

2.3 不同類型乳酸菌及接種量對(duì)葡萄酒中生物胺含量的影響（圖3）

乳酸菌是進(jìn)行MLF的主要微生物，具有一定的氨基酸脫羧酶活性，有研究認(rèn)為，乳酸菌會(huì)影響葡萄酒中的生物胺含量[12-14]。本研究主要對(duì)比了在相同發(fā)酵條件下，不同類型乳酸菌及接種量對(duì)葡萄酒中生物胺含量影響，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，乳酸菌類型對(duì)葡萄酒中生物胺含量有一定影響，當(dāng)接種同類型的乳酸菌時(shí)，乳酸菌接種量越大，葡萄酒中生物胺含量越高。當(dāng)接種10 mg/L乳酸菌時(shí)，葡萄酒中生物胺含量顯著低于接種20 mg/L乳酸菌時(shí)的生物胺含量。同時(shí)，當(dāng)接種同等量不同類型的乳酸菌，接種乳酸菌Ⅲ時(shí)，葡萄酒中生物胺含量較高。因?yàn)楸狙芯坎捎玫氖窍嗤|(zhì)的葡萄酒為樣品，所以造成以上差異的原因可能是乳酸菌中氨基酸脫羧酶活性的差異。

圖3 不同類型乳酸菌及接種量對(duì)葡萄酒中生物胺含量的影響

2.4 氨基酸脫羧酶對(duì)葡萄酒中生物胺含量的影響

輔酶5’磷酸吡哆醛是氨基酸脫羧酶的輔酶，能夠增加氨基酸脫羧酶的活性[15]。為了進(jìn)一步證明氨基酸脫羧酶活性對(duì)生物胺的影響，本實(shí)驗(yàn)以其中一個(gè)傳統(tǒng)發(fā)酵工藝為空白對(duì)照組，另一個(gè)為處理樣，即添加能提高氨基酸脫羧酶活力的輔酶5’磷酸吡哆醛0.05 g/L，結(jié)果見表2。由表2可看出，與空白對(duì)照組相比較，添加輔酶5’磷酸吡哆醛的葡萄酒中，生物胺含量有所提高，生物胺總含量由27.165 mg/L上升至29.061 mg/L，其中尸胺和腐胺含量上升的趨勢(shì)最為明顯，可以說(shuō)明，氨基酸脫羧酶活性是影響生物胺含量的關(guān)鍵因素之一。

表2 氨基酸脫羧酶對(duì)葡萄酒中生物胺含量的影響 (mg/L)

圖4 不同貯藏溫度對(duì)葡萄酒中生物胺含量的影響

2.5 不同貯藏溫度對(duì)葡萄酒中生物胺含量的影響（圖4）

由圖4可以看出，發(fā)酵結(jié)束后，隨著貯藏溫度的上升，葡萄酒中的8種生物胺含量也隨之增加。其中，在貯藏溫度為0℃和4℃時(shí)，葡萄酒中的精胺、亞精胺和色胺含量在5%和1%水平上均沒有顯著性差異，但當(dāng)貯藏溫度為22℃時(shí)，這3種生物胺的含量顯著上升。說(shuō)明貯藏溫度在0℃和4℃時(shí)，溫度對(duì)葡萄酒中這3種生物胺含量影響較小，但當(dāng)貯藏溫度上升到22℃時(shí)，溫度對(duì)其含量的影響較大。苯乙胺和尸胺的含量則在3個(gè)貯藏溫度條件下的差異均極顯著，而組胺和腐胺含量則在3種貯藏溫度下在5%和1%水平下均無(wú)顯著差異。說(shuō)明貯藏溫度對(duì)葡萄酒中生物胺含量有一定的影響，在葡萄酒貯藏時(shí)，應(yīng)避免貯藏溫度過(guò)高，盡可能在低溫條件下貯藏。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)不同工藝參數(shù)（包括酵母類型及接種量、酒精發(fā)酵溫度、乳酸菌類型及接種量、氨基酸脫羧酶活性和貯藏溫度等）的釀酒試驗(yàn)，其次利用高效液相色譜法對(duì)葡萄酒中生物胺含量檢測(cè)分析。結(jié)果表明，氨基酸脫羧酶的活性是影響生物胺含量的重要因素，接種不同類型酵母菌或乳酸菌時(shí)，對(duì)葡萄酒中的生物胺含量有一定的影響，但其接種量對(duì)生物胺含量的影響較小。在葡萄酒生產(chǎn)過(guò)程中可以通過(guò)生產(chǎn)工藝的調(diào)控，降低葡萄酒中的生物胺含量，以此保障和提升葡萄酒的食品安全性能。