丁佳寧，馬進(jìn)原，朱全剛，

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)研究室，上海 200437；2.上海市皮膚病醫(yī)院藥劑科，上海 200443)

人類基因組測(cè)序鑒定發(fā)現(xiàn)，在人類基因組的30億個(gè)堿基對(duì)中，僅有約2%的堿基對(duì)編碼蛋白質(zhì)，即人類體細(xì)胞的180 000個(gè)轉(zhuǎn)錄本中，僅20 000個(gè)編碼蛋白質(zhì)，其余則為非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)[1-2]。非編碼RNA可分為管家RNA、短鏈非編碼RNA(sncRNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)等亞型。目前，14 880個(gè)lncRNA已被ENCORE項(xiàng)目所確定，許多的lncRNA有自身的啟動(dòng)子，多存在于哺乳動(dòng)物中，而越來(lái)越多的研究證明，lncRNA在細(xì)胞分化、遷移和凋亡中能夠發(fā)生分子交換，并通過(guò)改變基因表達(dá)模式使細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生改變[3-4]。第一個(gè)lncRNA——lncRNAH19，由Brannan等發(fā)現(xiàn)[5]。lncRNA起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，不具備生物學(xué)功能，但越來(lái)越多的研究表明，其參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過(guò)程。lncRNA表達(dá)或功能異常與人類疾病的發(fā)生密切相關(guān)，包括腫瘤[6]、1型糖尿病[7]、心血管疾病[8]和退行性神經(jīng)疾病等[9]。研究亦證實(shí)lncRNA參與了多種腫瘤信號(hào)通路，如Notch、mTOR、NF-Kb和Wnt[10-11]。它們影響和調(diào)節(jié)著細(xì)胞周期及細(xì)胞的凋亡、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。lncRNA可以是抑癌基因，也可以是致癌基因。如lncRNA GAS8-AS1過(guò)表達(dá)能抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖[12]，而沉默Linc00673可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[13]。2003年，Zhang等首次發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3是垂體瘤的一個(gè)潛在的腫瘤抑制因子，之后研究者又在其他腫瘤上對(duì)其進(jìn)行了研究，使人母系表達(dá)基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)在腫瘤中的作用和機(jī)制得到了更好地闡明。本文總結(jié)了MEG3的功能及其在腫瘤發(fā)生中作用的研究進(jìn)展。

1 lncRNA MEG3的功能

MEG3是一種母系印記基因編碼的lncRNAs，它是小鼠母系印記基因Gtl2的人類同系物，首次識(shí)別于小鼠12號(hào)染色體末端，長(zhǎng)度為35 000的單拷貝印記基因，是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的有腫瘤抑制功能的長(zhǎng)鏈非編碼RNA[14]。

母系表達(dá)基因MEG3與父系表達(dá)基因DLK1可構(gòu)成DLK1-MEG3印記域，它們分別位于人染色體14q32.3和鼠染色體12。其轉(zhuǎn)錄缺乏明顯的開(kāi)放閱讀框，位于蛋白編碼基因DLK1的100 000處，啟動(dòng)子易發(fā)生差異甲基化，且轉(zhuǎn)錄方向與DLK1一致。此印記域包含兩個(gè)差異甲基化區(qū)域(DMRs)，分別是IG-DMR和MEG3-DMR。MEG3-DMR的甲基化模式取決于IG-DMR，表明它們之間存在等級(jí)相互作用和明顯的特性[15]。

MEG3在多數(shù)正常組織中均有表達(dá)，如在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、唾液腺、胰腺和腎臟上皮細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中表達(dá)水平較高，其在成年小鼠腎上腺、腦垂體和大腦中也有表達(dá)，然而在人類腫瘤(如非小細(xì)胞肺癌、胃癌、子宮頸癌等)中異常低表達(dá)或不表達(dá)[16]。過(guò)表達(dá)的MEG3能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，說(shuō)明MEG3可能是一個(gè)抑癌基因。研究表明其發(fā)揮抑癌作用與DNA甲基化、cAMP途徑[17]、p53基因表達(dá)[18]、Rb途徑[19]以及影響血管生成[20]有關(guān)。MEG3的表達(dá)受表觀遺傳調(diào)控，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)CpG異常甲基化。此外，基因拷貝數(shù)缺失被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的另一機(jī)制。MEG3缺失一方面能夠上調(diào)父系表達(dá)基因，另一方面可以下調(diào)其下游基因和抑癌基因miRNAs的表達(dá)水平，但這一觀點(diǎn)仍存在爭(zhēng)議[21]。

2 lncRNA MEG3與腫瘤

隨著MEG3在垂體瘤中的研究，使得其與腫瘤的關(guān)系逐漸受到關(guān)注。目前已有多篇研究分別報(bào)道了MEG3在非功能性垂體腺瘤[16,22-24]、腦膜癌[25]、肝癌[26]、肺癌[19]、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤[27]和前列腺癌[26-28]等多個(gè)腫瘤中的作用。

2.1 MEG3與非功能性垂體腺瘤

Zhang等于2003年首次發(fā)現(xiàn)MEG3參與了腫瘤的發(fā)生。首先，他們克隆了一個(gè)cDNA，它是來(lái)自MEG3(一個(gè)未知功能的母系表達(dá)基因)的一個(gè)新型的轉(zhuǎn)錄本，并研究了MEG3 cDNA亞型MEG3a的分子克隆、表達(dá)水平以及抗增殖作用。為了確定腫瘤形成的發(fā)病機(jī)制，他們通過(guò)cDNA代表性差異分析法比較發(fā)現(xiàn)MEG3 cDNA片段在正常人垂體組織中表達(dá)較高，而在臨床非功能性垂體腺瘤中表達(dá)較低或缺失。之后通過(guò)Northern印跡雜交和RT-PCR進(jìn)一步研究證實(shí)MEG3在非功能性垂體腺瘤和多種人癌細(xì)胞中都不表達(dá)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)MEG3可通過(guò)異位表達(dá)抑制人癌細(xì)胞HeLa、MCF-7和H4的增殖。基因組分析表明MEG3位于染色體14q32.3位點(diǎn)，此位點(diǎn)已被報(bào)道存在抑癌基因，并參與了腦膜癌的發(fā)病機(jī)制。這些數(shù)據(jù)表明MEG3可能是一個(gè)新型的抑癌基因，它在人垂體腺瘤的發(fā)展中起重要作用[16]。

Cheunsuchon等對(duì)MEG3抑制垂體腺瘤增殖的機(jī)制做了更深入的研究，人類臨床無(wú)功能垂體腺瘤(NFAs)中MEG3選擇性表達(dá)缺失，但是此位點(diǎn)上其他基因的表達(dá)情況還未見(jiàn)報(bào)道。RT-PCR評(píng)估了44例人垂體腺瘤(臨床無(wú)功能垂體腺瘤25例、促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤7例、生長(zhǎng)激素腺瘤7例、催乳素腺瘤5例)和10例正常的垂體中DLK1-MEG3位點(diǎn)上24個(gè)基因的表達(dá)水平。流式細(xì)胞術(shù)分析了5個(gè)能抑制癌細(xì)胞增殖的miRNAs，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)均很低。研究發(fā)現(xiàn)18個(gè)基因，包括DLK1-MEG3位點(diǎn)上的13個(gè)miRNAs的表達(dá)水平都明顯下調(diào)。促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤和催乳素腺瘤中分別有9個(gè)和7個(gè)miRNAs明顯下調(diào)，而7個(gè)生長(zhǎng)激素腺瘤中沒(méi)有。另外，miR-134轉(zhuǎn)染PDFS細(xì)胞后，其G2/M期受到阻滯。這些數(shù)據(jù)表明NFAs中DLK1-MEG3位點(diǎn)發(fā)生了沉默，且miRNAs能抑制PDFS細(xì)胞增殖，即人NFAs中DLK1-MEG3位點(diǎn)起著腫瘤抑制的作用[23]。

Chunharojrith等還發(fā)現(xiàn)MEG3能明顯抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)，并阻滯細(xì)胞周期G1期。此外，p53基因失活完全阻礙了MEG3的腫瘤抑制作用，這表明MEG3的腫瘤抑制作用是由p53介導(dǎo)的[24]。

2.2 MEG3與腦膜瘤

腦膜瘤是最常見(jiàn)的惡性腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的15%～25%。早期人們認(rèn)為腫瘤的發(fā)生是由于染色體22上NF2基因的失活，但是原因尚未明確。染色體14q32異常與腦膜瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，因此猜想該位點(diǎn)可能存在腫瘤抑制基因。

Zhang等對(duì)正常蛛網(wǎng)膜組織和不同分級(jí)的腦膜瘤組織通過(guò)RT-PCR檢測(cè)MEG3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MEG3在正常蛛網(wǎng)膜組織和細(xì)胞中高表達(dá)，但在大多數(shù)腦膜癌組織和細(xì)胞中不表達(dá)，且MEG3表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)有密切關(guān)系?；蚪MDNA甲基化分析提示，MEG3基因啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和印記控制區(qū)甲基化程度亦與腫瘤分級(jí)顯著相關(guān)。功能上，溴化脫氧尿苷摻入法和集落形成實(shí)驗(yàn)提示MEG3可抑制腦膜瘤細(xì)胞DNA的合成和增殖，而無(wú)啟動(dòng)子的MEG3和DLKL不能。且MEG3等位基因缺失，高級(jí)別腫瘤患病率增加。此外，MEG3能夠刺激癌細(xì)胞中p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。這些數(shù)據(jù)表明lncRNA MEG3可能是一個(gè)抑癌基因[25]。

2.3 MEG3與肝癌

通過(guò)微陣列分析了惡性肝細(xì)胞中23 000個(gè)lncRNA，顯示有712(約占3%)個(gè)lncRNAs表達(dá)水平下調(diào)，其中，MEG3表達(dá)下調(diào)至1/210。Braconi等通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)，與正常肝細(xì)胞相比，MEG3在4種人肝癌細(xì)胞株(HepG2、Huh-7、PLC-PRF/5、hep-3B)中的表達(dá)明顯減少。RNA原位雜交結(jié)果顯示MEG3在無(wú)腫瘤正常肝中表達(dá)很高，而在肝癌組織中不表達(dá)或低表達(dá)。肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的MEG3能抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。甲基化特異性PCR顯示MEG3啟動(dòng)子發(fā)生甲基化，采用甲基化抑制劑或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶處理癌細(xì)胞后MEG3的表達(dá)升高。由于miRNA-29a可以調(diào)節(jié)DNMT1/3，他們通過(guò)評(píng)估m(xù)iRNA-29的表達(dá)來(lái)研究miRNA-29和MEG3的依賴性調(diào)節(jié)。過(guò)表達(dá)的miRNA-29a增加MEG3的表達(dá)水平。GTL2是MEG3的小鼠同源物，在肝細(xì)胞特異性miRNA-29a/b1基因敲除小鼠的肝組織中表達(dá)下調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明miRNA-29低表達(dá)導(dǎo)致的lncRNA MEG3甲基特異性調(diào)節(jié)可能有助于肝癌的生長(zhǎng)，這突出顯示了兩種非編碼RNA的相互關(guān)系，miRNA、lncRNA和基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控[26]。

2.4 MEG3與肺癌

超甲基化已被證明能夠?qū)е禄虮磉_(dá)缺失，Kruer等證明了MEG3的表達(dá)通過(guò)Rb通路被調(diào)節(jié)，并與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。微陣列分析了離體基因缺失小鼠和野生型小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞的3個(gè)Rb家族(TKO)，Gtl2/MEG3的表達(dá)顯示出明顯的基因沉默，并且Gtl2/MEG3過(guò)表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。帕博昔布是CDK4/6抑制劑，作用于A549和SK-MES-1細(xì)胞后，MEG3的表達(dá)呈劑量依賴性增加，但是pRb/p107敲除則會(huì)削弱此效果。此外，在2種肺癌細(xì)胞中，pRb的磷酸化不足突變體的表達(dá)能夠增加MEG3的水平。采用帕博昔布處理pRb磷酸化不足突變體細(xì)胞能降低pRb相關(guān)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)的表達(dá)，與此同時(shí)，DNMT1降低能導(dǎo)致MEG3表達(dá)升高。帕博昔布導(dǎo)致MEG3位點(diǎn)基因甲基化下調(diào)，其作用類似于5-氮雜-2-脫氧胞苷。對(duì)于藥物誘導(dǎo)MEG3表達(dá)的A549和SK-MES-1細(xì)胞，反義寡脫氧核苷酸沉默可以部分逆轉(zhuǎn)帕博昔布介導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制，而TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)揭示了RB通路干擾的肺癌細(xì)胞中MEG3的表達(dá)減低。這些數(shù)據(jù)表明pRb-DNMT1通路的干擾導(dǎo)致MEG3表達(dá)降低，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞的增殖[19]。

Lu等通過(guò)MTT法和克隆形成試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)的MEG3對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞SPC-A1、A549的增殖有明顯的抑制作用，Hoechst染色法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MEG3能促進(jìn)細(xì)胞凋亡；一般來(lái)說(shuō)，泛素-蛋白酶途徑的快速降解會(huì)導(dǎo)致p53蛋白水平下降，p53蛋白的泛素化主要是由MDM2(E3泛素連接酶)介導(dǎo)的。通過(guò)蛋白印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后SPC-A1細(xì)胞的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)MDM2蛋白水平下降，p53蛋白水平上調(diào)，但p21Cip1(p53蛋白靶基因)蛋白水平無(wú)明顯變化，表明通過(guò)下調(diào)MDM2蛋白水平，MEG3能激活p53蛋白表達(dá)，但并不能刺激p21Cip1表達(dá)[28]。

2.5 MEG3與胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤

Modali等發(fā)現(xiàn)，胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(PNETs)中MEN1基因編碼的menin蛋白雙等位基因的失活與多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤Ⅰ型(MEN1)綜合征相關(guān)是公認(rèn)的，但是menin缺失/失活是否引發(fā)腫瘤的發(fā)生尚未知曉。研究發(fā)現(xiàn)menin通過(guò)MEG3啟動(dòng)子CRE位點(diǎn)上發(fā)生的組蛋白-H3賴氨酸-4甲基化和CpG低甲基化激活了MEG3，使轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白與之結(jié)合。MIN6細(xì)胞(胰島素分泌小鼠PNET細(xì)胞系)中MEG3的過(guò)表達(dá)能抑制細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，據(jù)此認(rèn)為PNET細(xì)胞中MEG3有抑癌活性。基因微陣列分析提示MIN6鼠胰島細(xì)胞中MEG3的過(guò)表達(dá)下調(diào)了原癌基因c-MET(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體)的表達(dá)，并明顯抑制了細(xì)胞遷移/侵襲。與正常細(xì)胞相比，鼠或人MEN1相關(guān)的PNETs中 MEG3表達(dá)下調(diào)，而c-MET表達(dá)上調(diào)。因此，通過(guò)將抑癌基因MEG3和抑制原癌基因c-MET的手段結(jié)合，能夠誘導(dǎo)menin蛋白的腫瘤抑制因子活性。MEG3和c-MET的表達(dá)在人散發(fā)性胰島素瘤中被改變，MEG3啟動(dòng)子CRE位點(diǎn)超甲基化下調(diào)了MEG3的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)也為β細(xì)胞功能維持相關(guān)增殖的機(jī)制闡明提供了新的視角。此外，DNA去甲基化藥物能抑制MIN6鼠胰島素細(xì)胞增殖，并激活MEG3的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明通過(guò)lncRNA MEG3的表觀激活和c-MET的失活有望治療胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤和胰島素瘤[27]。

2.6 MEG3與前列腺癌

Ribarska等通過(guò)微陣列分析了前列腺良性組織和腫瘤組織中12種印記基因HYMAI，PLAGL1/ZAC1，CDKN1C，MEG3，PEG3，PEG10，SGCE，PPP1R9A，NDN，SNRPN/SNURF，INPP5F和GNAS的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它們存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。其中有9個(gè)基因(HYMAI,PLAGL1/ZAC1，SGCE，PEG10,INPP5F,CDKN1C，MEG3，NDN和PEG3)表達(dá)水平下調(diào)，PPP1R9A和GNAS表達(dá)上調(diào)，而SNRPN/SNURF在良性組織和腫瘤組織表達(dá)都較高，這可能是由基因特定轉(zhuǎn)錄變異體的差異表達(dá)引起的[29]。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)前列腺癌腫瘤組織中MEG3表達(dá)較低，DMRs分析前列腺良性組織和腫瘤組織中CpGs平均甲基化水平無(wú)顯著性差異，ZAC1 DMR,KvDMR，7q21 DMR2，MEG3 DMR和NDN DMR甲基化程度達(dá)35%～70%。MEG3 DMR CpG2甲基化和MEG3的表達(dá)水平有較強(qiáng)的相關(guān)性(ρ=0.535，P<0.001)[30]。

Luo等RT-PCR檢測(cè)了21個(gè)前列腺癌患者腫瘤組織和癌旁組織中MEG3的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中MEG3的表達(dá)水平顯著下調(diào)，此外，他們還評(píng)估了MEG3的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者并無(wú)顯著關(guān)系。過(guò)表達(dá)的MEG3能下調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1，并阻滯細(xì)胞周期G0/G1期，從而抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖。為了探討體內(nèi)MEG3水平上調(diào)是否能抑制腫瘤的形成，將穩(wěn)轉(zhuǎn)質(zhì)粒pCDNA MEG3和空載的PC3細(xì)胞分別皮下注射到裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)MEG3組裸鼠腫瘤體積和體重均偏小。與免疫印跡結(jié)果相似，免疫組化分析顯示Bax上調(diào)，Cyclin D1和Bcl-2下調(diào)，且pCDNA MEG3組中caspase3活性增強(qiáng)。這些結(jié)果提示上調(diào)MEG3的表達(dá)能顯著抑制體內(nèi)前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并延緩腫瘤的生長(zhǎng)進(jìn)程。他們的研究提出MEG3在前列腺癌的分子病因?qū)W中發(fā)揮著重要作用，這表明MEG3在前列腺癌治療中有著潛在的作用[31]。

3 小結(jié)

已有研究表明，MEG3是一個(gè)重要的抑癌基因，其在大多數(shù)腫瘤中表達(dá)下調(diào)，并與整體預(yù)后相關(guān)。其主要機(jī)制包括：①染色體14q32是一個(gè)腫瘤抑制基因位點(diǎn)，其等位基因的丟失與實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病有關(guān)，而MEG3位于14q32位點(diǎn)；②在多種正常組織中表達(dá)，但在惡性腫瘤組織中低表達(dá)或表達(dá)缺失；③CpG甲基化導(dǎo)致MEG3表達(dá)沉默；④MEG3表達(dá)與腫瘤生長(zhǎng)抑制相關(guān)；⑤MEG3與p53/MDM2的相互調(diào)節(jié)維持著細(xì)胞增殖。父系和母系表達(dá)基因DLK1/MEG3保持著動(dòng)態(tài)平衡，而在實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，這種平衡遭到破壞。此外，MEG3可能與MAPK信號(hào)通路相互作用從而抑制細(xì)胞增殖。

總之，lncRNA MEG3是一種極具應(yīng)用前景的抑癌基因，但其在細(xì)胞生物學(xué)中的重要性以及其在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用途徑仍有待進(jìn)一步研究。