王 鶴，厲新新，孫曉會，吳紅男，馮卓蕾，劉麗娟

甘草黃酮（licorice flavonoids），具有抗氧化、抑制炎癥反應、降血脂、抗腫瘤等作用[1]。有研究顯示，甘草黃酮能夠預防大鼠實驗性糖尿病的發(fā)生，其作用機制與提高超氧化物歧化酶表達有關[2]。糖尿病的發(fā)生與患者的長期氧化應激狀態(tài)有關，視網(wǎng)膜色素上皮(retina pigment epithelium，RPE)細胞正常代謝環(huán)境改變導致抗氧化能力降低，影響了視網(wǎng)膜的正常代謝，導致糖尿病患者視力下降[3]。鑒于甘草黃酮具有較強的抗氧化性功能，本文擬通過采用體外高糖條件下培養(yǎng)RPE細胞，研究甘草黃酮對高糖誘導的RPE細胞氧化損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

RPE細胞(美國 ATCC公司)，甘草黃酮（美國Sigma公司，純度＞99%)，二甲基亞砜（北京索萊寶科技有限公司），胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基干粉 (美國GIBCO公司)，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽 [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)，2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯 （2',7'-Dichlorodi hydrofluorescein diacetate，H2DCFDA）熒光探針（美國 BD 公司），Caspase-3及Caspase-9抗體（上海碧云天公司）。

1.2 方法

1.2.1 RPE細胞的培養(yǎng) RPE細胞常規(guī)培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，每3 d傳代1次，取對數(shù)期（此時期細胞都處于生長分裂旺盛時期，其細胞大小處于較穩(wěn)定的情況）生長的細胞進行實驗，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃，CO2體積分數(shù)為5%。

1.2.2 RPE細胞分組 共分4組，每組5個復孔：（1）對照組 以正常培養(yǎng)液(葡萄糖濃度為5.5 mmol/L)培養(yǎng)細胞36 h。（2）高糖組 以葡萄糖濃度為40 mmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞36 h。（3）甘草黃酮低濃度組 10-9mol/L的甘草黃酮培養(yǎng)細胞24h后，更換為葡萄糖濃度為40 mmol/L的培養(yǎng)液繼續(xù)作用12 h。（4）甘草黃酮高濃度組 10-8mol/L的甘草黃酮培養(yǎng)細胞24 h后，更換為葡萄糖濃度為40 mmol/L的培養(yǎng)液繼續(xù)作用12 h。

1.2.3 MTT法測定細胞增殖 MTT法是一種檢測細胞存活率的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能[4]。 RPE 細胞培養(yǎng)于 96孔板內(nèi)，每孔 200 μl，細胞密度為 1×104個/L，各孔加入 10 μl MTT(5 g/L)，置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)4 h，去除上清液，加入100 μl DMSO溶液，低速振蕩10 min后在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔570 nm的吸光度值（OD）。

1.2.4 流式細胞技術檢測RPE細胞內(nèi)活性氧表達RPE細胞培養(yǎng)于6孔板中，每孔500 μl，細胞密度為1×105個/L， 磷酸緩沖液 （phosphate buffer solution，PBS）沖洗 3 遍，離心（1000 r/min）后收集細胞，黑暗中在室溫下加入5 μl H2DCFDA染料，15 min后流式細胞儀檢測并分析細胞內(nèi)活性氧 (reactive oxygen species,ROS)表達量變化。

1.2.5 ROS含量變化的形態(tài)學觀察 RPE細胞經(jīng)上述方法處理后，加入10 μm/L的氧敏感熒光探針H2DCFDA，黑暗中在室溫下孵育20 min，熒光顯微鏡下拍照。

1.2.6 細胞凋亡的形態(tài)學觀察 采用Hoechst染色法定量觀察細胞凋亡情況，按照試劑盒說明更換細胞培養(yǎng)液，并用PBS沖洗3遍，在150 μL的Binding Buffer中分別加入 Hoechst試劑 5 μl及 PI試劑 2 μl混勻，室溫避光反應5 min，熒光顯微鏡下觀查并拍照，統(tǒng)計分析凋亡細胞比例。

1.2.7 凋亡因子相關蛋白檢測 收集細胞，置于冰浴上，胰蛋白酶消化后提取蛋白質(zhì)并行10%SDS-PAGE凝膠電泳，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參照進行免疫印跡分析，檢測細胞內(nèi)Caspase-3及Caspase-9蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0進行統(tǒng)計學處理，結(jié)果采用均數(shù)±標準差（s）表示，采用成組 t檢驗及單因素方差分析(One-way ANOVA)）法進行分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 甘草黃酮濃度依賴性的提高RPE細胞活力

40 mmol/L葡萄糖溶液處理后，高糖組RPE細胞存活率下降到40.45%±3.27%，與對照組（98.336%±2.98%）比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。用10-9mol/L、10-8mol/L甘草黃酮處理后，RPE細胞存活率逐漸提高，分別為64.76%±3.23%和78.67%±2.57%，與高糖組（40.45%±3.27%）比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表 1)。

2.2 RPE細胞內(nèi)ROS改變

H2DCFDA熒光探針標記法是一種檢測細胞內(nèi)ROS生成量變化的檢查方法，細胞氧化損傷程度越重，主峰越向右側(cè)偏移[5]。流式細胞技術結(jié)果顯示，對照組細胞內(nèi)ROS表達均較低，ROS主峰位于基線左側(cè)，高糖組DCF熒光信號明顯增強，ROS主峰位于基線右側(cè)，不同濃度甘草黃酮干預后，熒光信號強度逐漸減弱，ROS主峰向基線左側(cè)移位（圖1）。

表1 MTT法檢測甘草黃酮對高糖誘導的RPE細胞存活率的影響（s）

表1 MTT法檢測甘草黃酮對高糖誘導的RPE細胞存活率的影響（s）

注：*與對照組比較P＜0.05。

?

2.3 熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)ROS改變

熒光顯微鏡下，未發(fā)生氧化損傷的細胞核呈暗綠色低熒光，當氧化壓力刺激時，ROS攻擊細胞膜及細胞器，細胞核染色后呈亮綠色高熒光[6]。本研究結(jié)果顯示，對照組細胞核表現(xiàn)為均一低熒光(圖2A)；高糖組出現(xiàn)明顯增多的綠色高熒光，提示細胞發(fā)生氧化損傷(圖2B)；甘草黃酮處理后綠色高熒光細胞核數(shù)量逐漸減少，提示氧化損傷細胞隨之減少 (圖2C、2D)，說明甘草黃酮能夠計量依賴性的抑制RPE細胞發(fā)生氧化損傷。

2.4 甘草黃酮對RPE細胞凋亡的影響

熒光顯微鏡下，對照組背景熒光暗黑色，可見數(shù)個散在凋亡細胞核（暗藍色低熒光，圖3A），細胞凋亡率為（1.67±0.98）%；高糖組細胞核著色不均勻，凋亡細胞呈亮藍色高熒光 (圖3B)，細胞凋亡率為（67.33±4.44）%，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。 10-9mol/L、10-8mol/L 甘草黃酮處理后凋亡細胞數(shù)量逐漸減少(圖3C、3D)，細胞凋亡率分別為（48.67±3.90）%、（36.33±3.85）%，與高糖組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

圖1 流式細胞技術檢測RPE細胞內(nèi)ROS改變 橫坐標是ROS熒光強度；縱坐標是細胞計數(shù)。1A為對照組，ROS主峰位于基線左側(cè)；1B為高糖組，ROS主峰位于基線右側(cè)；1C為甘草黃酮低濃度組，ROS主峰向基線左側(cè)移位；1D甘草黃酮高濃度組，ROS主峰向基線左側(cè)移位。

圖2 熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)ROS改變 2A為對照組；2B為高糖組；2C為甘草黃酮低濃度組；2D為甘草黃酮高濃度組

圖3 甘草黃酮對高糖誘導RPE細胞凋亡影響。3A為對照組；3B為高糖組；3C為甘草黃酮低濃度組；3D為甘草黃酮高濃度組

2.5 Caspase-3及caspase-9蛋白表達水平檢測

RPE細胞經(jīng)高糖處理后，凋亡蛋白Caspase-3及Caspase-9的表達均明顯上調(diào) （相對表達量分別為250.84%±8.90%及270.03%±5.90%），與對照組（相對表達量為105.71%±5.99%）比較差異極具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)，甘草黃酮劑量依賴性的抑制Caspase-3及Caspase-9的表達，相對表達量分別下降到（162.70±6.44）%、（132.39±4.56）%和（224.85±5.44）%、（169.57±6.31）%，與高糖組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)（圖 4）。

表2 各組RPE細胞凋亡率比較（

表2 各組RPE細胞凋亡率比較（

注：*與對照組比較P＜0.05。

?

表3 各組Caspase-3及Caspase-9蛋白相對表達比較（

表3 各組Caspase-3及Caspase-9蛋白相對表達比較（

注：以GAPDH為內(nèi)參。單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。* 與對照組比較，P＜0.05； # 與高糖組比較，P＜0.05。

?

3 討論

RPE細胞對氧化應激損傷敏感，而且一旦死亡便不能再生，因此，其結(jié)構(gòu)與功能完整對維持視網(wǎng)膜正常功能至關重要[7]。為了研究視網(wǎng)膜病變的發(fā)生機理并探索出更多的治療性藥物，國內(nèi)外學者嘗試了大量方法誘導RPE細胞凋亡，例如：高糖、H2O2、紫外線輻射、激素、化學藥物等[8-10]。本實驗使用40 mmol/L濃度的葡萄糖建立了RPE細胞高糖氧化應激模型，觀查甘草黃酮對RPE細胞的保護作用。結(jié)果顯示，40 mmol/L濃度的葡萄糖引起RPE細胞活力降低，給予10-9mol/L、10-8mol/L甘草黃酮作用后，細胞活力增加。

當機體的抗氧化防御屏障功能被破壞時，會產(chǎn)生大量的ROS，ROS的生成與中和失衡，對RPE細胞造成不可逆損傷[7]。過量生成的ROS可直接或間接通過損傷線粒體DNA導致線粒體呼吸鏈功能受損，進一步促使ROS釋放，最終形成惡性循環(huán)并加速細胞凋亡[10]。H2DCFDA熒光探針是一種檢測細胞氧化應激狀態(tài)的染色方法，本實驗中，我們分別采用流式細胞技術及熒光顯微鏡觀察高糖對RPE細胞的氧化損傷程度。2種觀察結(jié)果結(jié)論一致：高糖刺激下RPE細胞氧化損傷明顯，甘草黃酮可以劑量依賴性的抑制高糖誘導的RPE細胞氧化應激損傷。

高糖刺激RPE細胞后產(chǎn)生的大量氧化代謝產(chǎn)物堆積引起細胞毒性損傷，大量自由基通過線粒體損傷引起RPE細凋亡[11-13]。實驗中，Hoechst染色顯示，高糖組中凋亡的RPE細胞數(shù)量明顯升高，Western blot結(jié)果顯示，高糖組細胞中Caspase-3及Caspase-9蛋白的表達均明顯增加，提示高糖誘導了RPE細胞凋亡，甘草黃酮通過降低Caspase-3及Caspase-9的表達發(fā)揮抗細胞凋亡作用。

綜上所述，甘草黃酮能夠有效抑制高糖誘導的RPE細胞凋亡，抑制效應與濃度呈正相關。本研究為預防和治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變提供了新的干預措施。

圖4 甘草黃酮對RPE細胞內(nèi)Caspase-3及Caspase-9表達的影響