張 博，李鳳君，左中夫

糖尿病視網(wǎng)膜病變 (diabetic retinopathy，DR)人群不斷增加，晚期易導(dǎo)致失明，對患者的生活帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1]。近年來研究證實神經(jīng)退行性變亦是DR的重要發(fā)病機制，且早于微血管病變[2]。因此，有效預(yù)防和治療DR神經(jīng)病變亦尤為重要。中醫(yī)中藥在防治糖尿病中扮演重要的角色[3]。芍藥苷為芍藥的主要成分,被證實具有降低血糖及神經(jīng)保護等作用[4]，近期研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可通過HSP70/TLR4/NF-κB通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metallopeptidase-9，MMP-9）活化，從而改善 DR[5]，但 對Müller細(xì)胞的影響還未見報道。因此，本研究通過芍藥苷對糖尿病大鼠灌胃治療，探討芍藥苷對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的影響，期望為DR治療策略的探討提供更全面的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物分組及模型制備 SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量220～240 g(購自錦州醫(yī)科大學(xué)，編號：SCXK(遼)2014-16)。動物飼養(yǎng)室溫 25℃，濕度43%，自由攝食飲水。將動物隨機分成對照組、糖尿病組、芍藥苷組及二甲雙胍組，每組各10只。后3組大鼠采用單次腹腔注射STZ (50 mg·kg-1)，72 h后檢測尾靜脈血糖，將血糖濃度＞16.7 mmol·L-1的大鼠作為糖尿病模型。模型誘導(dǎo)成功后，依據(jù)文獻(xiàn)，芍藥苷組給予芍藥苷(20 mg·kg-1)灌胃治療[6]，每日2次。二甲雙胍組給予二甲雙胍(20 mg·kg-1)作為陽性對照[7]，溶于2 ml生理鹽水灌胃治療，每日1次。對照組、糖尿病組給予等劑量生理鹽水。實驗期間動態(tài)監(jiān)測大鼠血糖、體重變化。12 w后，進行各項指標(biāo)檢測，實驗遵循國家《實驗動物管理條例》。

1.1.2 試劑及儀器 鹽酸二甲雙胍、鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)(美國 Sigma公司)；芍藥苷(98.78%，南京格倫生物科技有限公司)；神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)、膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體(Glial glutamate transporter,GLAST)、谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)抗體(英國Abcam公司)；谷氨酸含量檢測試劑盒、熒光二抗及Western blot二抗(北京碧云天生物公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；冰凍切片機(德國SLEE公司)；水平電泳儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣本制備 12周后，每組取4只大鼠，水合氯醛麻醉后經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛固定。固定完成后將大鼠眼球取出于固定液中，4℃保存，用于免疫熒光。每組取6只大鼠水合氯醛深度麻醉，取新鮮視網(wǎng)膜(左眼)于2.5 ml EP管中，依據(jù)重量加蛋白裂解液，冰上剪碎，4℃離心機25 min后取上清，-20℃保存用于Western blot；右眼視網(wǎng)膜稱重勻漿后加無水乙醇1 mL，離心20 min后取上清-20℃保存用于視網(wǎng)膜谷氨酸含量檢測。

1.2.2 視網(wǎng)膜谷氨酸含量檢測 視網(wǎng)膜谷氨酸含量檢測應(yīng)用可見分光光度法，操作嚴(yán)格按照說明書進行，按照蛋白濃度計算處視網(wǎng)膜谷氨酸濃度。

1.2.3 免疫熒光檢測大鼠視網(wǎng)膜GFAP、GLAST表達(dá) 將固定液中的眼球取出后用20%蔗糖溶液脫水，OCT包埋后切片，厚度為12 μm。載玻片于PBS洗滌3次，每次5 min；5%山羊血清+0.1%Triton-100室溫孵育30 min；不洗，滴加兔抗大鼠GFAP(1：700)、兔抗大鼠 GLAST(1：600)，4 ℃過夜；PBS 洗滌 3次，每次5 min；滴加山羊抗兔二抗，室溫避光2 h；PBS洗滌3次，每次5 min；封片后熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 Western blot檢查大鼠視網(wǎng)膜GFAP、GLAST、GS相對表達(dá)量：BCA法測定蛋白濃度，確定電泳時加入15 μL樣品；開始電泳，調(diào)整電壓為90 V，待電泳條帶成一條直線時，調(diào)整電壓為120 V；半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜膜后取目的條帶，1%BSA室溫封閉2 h；加入一抗(兔抗大鼠 GFAP，1：10000；兔抗大鼠 GLAST，1：8000； 兔抗大鼠 GS，1：8000)，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌4次，每次5min；加入HRP標(biāo)記的二抗室溫2h，孵育后TBST洗滌4次，每次5 min；ECL試劑盒顯影，Image J軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析，所有數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差s)表示，計量數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及LSD檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模前后血糖體重變化

大鼠造模前，4組體重之間比較 (F=0.59，P＞0.05)，血糖之間比較(F=1.38，P＞0.05)，兩者均無統(tǒng)計學(xué)差異。造模12周后，4組之間相比，體重(F=2.42，P＜0.01)、血糖(F=26.63，P＜0.01)，均具有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比，糖尿病組、芍藥苷組及二甲雙胍組大鼠體重明顯降低，比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)，而3組之間比較，無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

與對照組相比，糖尿病組血糖均＞16.7mmol·L-1，與糖尿病組比較，芍藥苷組血糖有所下降但仍高于正常，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，二甲雙胍組與對照組之間未見明顯差異(P＞0.05)。（表1、圖1）

表1 各組大鼠血糖、體重(s，n=10)

表1 各組大鼠血糖、體重(s，n=10)

注：*與對照組相比，P＜0.01

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2.1 視網(wǎng)膜谷氨酸含量檢測

4組之間視網(wǎng)膜谷氨酸含量比較，有統(tǒng)計學(xué)差異(F=720.05，P＜0.01)。同對照組比較，糖尿病組谷氨酸含量明顯升高(P＜0.01)。同糖尿病組比較，芍藥苷組及二甲雙胍組谷氨酸含量明顯下降(P＜0.01)。見表2

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜谷氨酸含量(s，n=6)及免疫熒光檢測各蛋白表達(dá) s，n=4)

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜谷氨酸含量(s，n=6)及免疫熒光檢測各蛋白表達(dá) s，n=4)

注：*與對照組相比，P＜0.01；#與糖尿病組相比，P＜0.01。GFAP：視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白；GLAST：膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體

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2.2 免疫熒光檢測結(jié)果

GFAP在對照組主要微量表達(dá)于視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層，將對照組GFAP蛋白免疫熒光強度設(shè)定為100.00%，熒光強度分析結(jié)果，4組之間比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3226.47，P＜0.01)。同對照組比較，糖尿病組熒光強度明顯升高(P＜0.01)。同糖尿病組比較，芍藥苷組及二甲雙胍組熒光強度均不同程度下降且二甲雙胍組下降更明顯(P＜0.01)。 （表 2、圖 1）

GLAST在視網(wǎng)膜各層均有表達(dá)，將對照組GLAST蛋白免疫熒光強度設(shè)定為100.00%，熒光強度分析結(jié)果：4組之間比較，有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=587.19，P＜0.01)。 同對照組相比，糖尿病組 GLAST 熒光強度明顯下降(P＜0.01)，同糖尿病組比較，芍藥苷組及二甲雙胍組熒光強度明顯升高且二甲雙胍組升高更明顯(P＜0.01)。 （表 2、圖 1）

2.3 Western bolt檢測 GFAP、GLAST、GS 蛋白相對表達(dá)量

GFAP蛋白相對表達(dá)量：4組之間比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(F=423.02，P＜0.01)。同對照組比較，糖尿病組GFAP表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，同糖尿病組比較，芍藥苷組及二甲雙胍組GFAP均顯下降(P＜0.01)。（見表3、圖 2）

GLAST蛋白相對表達(dá)量：4組之間比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(F=129.56,P＜0.01)。同對照組比較，糖尿病組GLAST表達(dá)明顯減少(P＜0.01)，而同糖尿病組比較，芍藥苷組及二甲雙胍組GLAST表達(dá)明顯增加(P＜0.01)。 （表 3、圖 2）

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜蛋白相對表達(dá)量s，n=6)

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜蛋白相對表達(dá)量s，n=6)

注：* 與對照組相比，P＜ 0.01；# 與糖尿病組相比，P＜ 0.01。GFAP：視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白；GLAST：膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體；GS：谷氨酰胺合成酶

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圖1 免疫熒光檢測各組大鼠視網(wǎng)膜GFAP(紅色)、GLAST(綠色)的表達(dá)(箭頭示陽性表達(dá)，×200)。對照組：GFAP主要微量表達(dá)于節(jié)細(xì)胞層，GLAST在視網(wǎng)膜各層均有表達(dá)；糖尿病組：GFAP表達(dá)明顯增強，貫穿于視網(wǎng)膜全層，而GLAST表達(dá)較對照組明顯減少；芍藥苷組：與糖尿病組相比，GFAP表達(dá)有所減少，但仍高于對照組，而GLAST表達(dá)高于糖尿病組但低于對照組。二甲雙胍組：與對照組相比，GFAP與GLAST表達(dá)無明顯差別。 GCL：節(jié)細(xì)胞層；IPL：內(nèi)叢狀層；INL：內(nèi)核層；OPL：外叢狀層；ONL：外核層

GS蛋白相對表達(dá)量：4組之間比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.84,P＜0.01)。同對照組比較，糖尿病組GS表達(dá)明顯減少(P＜0.01)，而同糖尿病組比較，芍藥苷組與二甲雙胍組GS表達(dá)明顯增加(P＜0.01)。（表3、圖2）

圖2 Western blot檢測GFAP、GLAST、GS蛋白相對表達(dá)量。A對照組；B糖尿病組；C芍藥苷組；D二甲雙胍組。GFAP：視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白；GLAST：膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體；GS：谷氨酰胺合成酶；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶（內(nèi)參）

3 討論

近年研究顯示DR發(fā)病率逐年攀升，已經(jīng)成為發(fā)達(dá)國家成年人視力失明最主要的原因[8-9]。DR在我國的發(fā)病率也極高，最新發(fā)布的《中國2型糖尿病防治指南》就明確指出，DR在我國已經(jīng)成為成年人致盲的首要因素。DR的高致盲率增加了患者心理及生理負(fù)擔(dān)。神經(jīng)病變?yōu)槲⒀懿∽冎鈪⑴cDR的重要原因。因此，有效預(yù)防和治療DR神經(jīng)病變亦尤為重要。

中醫(yī)中藥在防治糖尿病中扮演重要的角色[3]。芍藥苷為芍藥的主要成分,具有降低血糖及神經(jīng)保護等作用[4]，本研究證實芍藥苷可以降低糖尿病大鼠的血糖，但效果低于二甲雙胍。近期研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可通過HSP70/TLR4/NF-κB信號通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞MMP-9激活，從而改善DR[5]，但對Müller細(xì)胞的影響還未見報道。Müller細(xì)胞占視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞的90%左右，在視網(wǎng)膜貫穿全層。Müller細(xì)胞具有支持及營養(yǎng)神經(jīng)元的作用，Müller細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常與DR發(fā)病關(guān)系密切[10]。GFAP是膠質(zhì)細(xì)胞特有的標(biāo)志性蛋白，特異性表達(dá)于膠質(zhì)細(xì)胞，但Müller細(xì)胞幾乎不表達(dá)GFAP，僅當(dāng)Müller細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常時可見GFAP表達(dá)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常情況下僅在視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層中有少量的GFAP蛋白表達(dá)，但DR狀態(tài)下視網(wǎng)膜不僅神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層GFAP表達(dá)明顯增加，而且免疫熒光觀察到視網(wǎng)膜GFAP陽性染色纖維分布空間范圍廣泛，幾乎貫穿視網(wǎng)膜神經(jīng)組織全層，其分布范圍與Müller細(xì)胞空間位置相同。而應(yīng)用芍藥苷后可見糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)GFAP表達(dá)明顯減少。該結(jié)果提示，芍藥苷可能通過有效抑制DR狀態(tài)下視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞活化，可能對視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞起到保護作用。

GLAST為Müller細(xì)胞中最主要的谷氨酸轉(zhuǎn)運體，主要表達(dá)于Müller細(xì)胞胞體和突起。GLAST可對視網(wǎng)膜突觸間隙內(nèi)過多的谷氨酸給予清除，從而大大減少其興奮毒性。Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜中唯一能合成GS的細(xì)胞，GS是Müller細(xì)胞的功能酶，能將轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸轉(zhuǎn)化為無毒谷氨酰胺[12]，從而降低谷氨酸的細(xì)胞毒性，保護視網(wǎng)膜[13]。糖尿病狀態(tài)下，視網(wǎng)膜中谷氨酸堆積，能產(chǎn)生神經(jīng)毒性，誘發(fā)并加重DR[14]。本研究顯示，糖尿病狀態(tài)下GFAP表達(dá)顯著增加，說明大Müller細(xì)胞已受損，而GFAP表達(dá)增加時GLAST、GS表達(dá)減少，谷氨酸含量增加，在給予芍藥苷后GFAP表達(dá)減少同時GLAST、GS在Müller細(xì)胞中的表達(dá)增加，谷氨酸含量降低。該結(jié)果進一步提示，芍藥苷可能通過抑制視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞活化進而改善了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的功能。這提示芍藥苷可能對于改善DR具有重要的意義。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷可通過抑制DR狀態(tài)下視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞活化，上調(diào)視網(wǎng)膜GLAST、GS表達(dá)，降低視網(wǎng)膜谷氨酸含量，提示芍藥苷對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病Müller細(xì)胞具有保護作用。這一發(fā)現(xiàn)對研究DR的治療策略提供了新的方向。但因DR發(fā)病機制復(fù)雜，芍藥苷對DR的作用可能涉及眾多途徑，因此芍藥苷對糖尿病視網(wǎng)膜病變的影響及機制仍待深入探討。