湛宇燦，韓曉靜，李白坤，蘇婧婧，劉竹青，劉瑞山，朱繼民

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心，安徽 合肥 230038；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，安徽 合肥 230012；5.安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，安徽 合肥 230032)

新產(chǎn)后、流產(chǎn)后及產(chǎn)褥期發(fā)生的與分娩或產(chǎn)褥有關(guān)的疾病統(tǒng)稱為產(chǎn)后病[1]。臨床上產(chǎn)后病以血瘀證多見。桃紅四物湯對婦科血瘀證療效顯著[2-3]，表現(xiàn)出“祛瘀”與“生新”雙重功效，其作用機(jī)制可能與Ras同源基因/Rho激酶(Ras homolog gene/Rho kinase，Rho/ROCK)信號通路[3-4]以及磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase，PI3K/Akt)信號通路等有關(guān)[2,5]。第10染色體缺失的堿性磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted in chromosome 10，PTEN)介于Rho/ROCK與PI3K/Akt通路之間，在細(xì)胞生長、分化、凋亡、遷移等方面起著重要的調(diào)控作用[6-8]。故推測桃紅四物湯治療產(chǎn)后血瘀證的作用機(jī)制可能與PTEN有關(guān)。

1 材料

1.1 動物 10月齡SPF級健康SD大鼠100只，其中雌性70只，雄性30只，體質(zhì)量220～250 g，由上海杰思捷實驗動物有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(滬)2013-0006]提供，常規(guī)飼養(yǎng)。本實驗獲得安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥物 益母草顆粒(批號 170107)：廣西禪方藥業(yè)有限公司；米非司酮片(批號 151201)：湖北葛店人福藥業(yè)有限公司；米索前列醇(批號 43160403)：華潤紫竹藥業(yè)有限公司。桃紅四物湯(桃仁、當(dāng)歸、白芍各9 g，紅花、川芎各6 g，熟地黃12 g)飲片：安徽省合肥樂家老鋪中藥飲片有限公司。參照文獻(xiàn)[9]方法，將桃紅四物湯飲片加入10倍量[容積(L)/質(zhì)量(kg)]75%的乙醇，冷凝回流提取2 h后，倒出藥液，然后用8倍量75%的乙醇，冷凝回流提取2 h，合并兩次提取液，濃縮至生藥含量為1.8 g/mL的提取液。

1.3 主要試劑 PTEN抗體：美國Cell Singling Technology公司；β-actin抗體：Sigma公司；山羊抗兔IgG/HRP及山羊抗小鼠IgG/HRP：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；化學(xué)發(fā)光法試劑盒：美國Thermo Fisher公司；TRIzol?試劑：美國Invitrogen公司；擴(kuò)增試劑盒RR820A、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RR047A：Takara公司。PTEN PCR上游引物為5′-ATGTTCAGTGGCGGAACTTG-3′，下游引物為5′-GTCACCACACACAGGCAATG-3′。

1.4 主要儀器 LEICA EG 1150 H石蠟包埋機(jī)：德國Leica公司；LEICA RM2135切片機(jī)：湖北孝感市泰維電子有限公司；CK2型倒置顯微鏡：日本Olympus公司；AllegraTM25R臺式高速冷凍離心機(jī)：美國Beckman Coulter公司；ViiA7熒光定量PCR儀：美國ABI公司；電泳-轉(zhuǎn)印系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 模型復(fù)制 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)留取8只雌性大鼠作為正常對照組，其余大鼠于20∶00以2∶1的比例將雌鼠與雄鼠合籠，次日晨進(jìn)行陰道栓和陰道涂片鏡檢，發(fā)現(xiàn)陰道栓和精子的當(dāng)天為妊娠的第1天。于妊娠第7天分別灌胃米非司酮(8.3 mg/kg，8∶00)和米索前列醇(0.1 mg/kg，18∶00)，給藥米索前列醇后向大鼠陰道塞入適合大小的棉球。次日8∶00和20∶00取出棉球，若觀察到棉球上有血則判定為早孕大鼠藥物流產(chǎn)[10]。大鼠流產(chǎn)第2天從眼內(nèi)眥取血，肝素抗凝后，檢測血液流變學(xué)指標(biāo)的變化。若全血黏度低切(1 s-1)≥45 mPa·s、高切(200 s-1)≥4.5 mPa·s則為血液流變性異常，判定為產(chǎn)后血瘀證[2]。

2.2 分組與給藥 選取模型復(fù)制成功的大鼠40只，隨機(jī)分為5組，即模型組(給予蒸餾水灌胃)，陽性對照組(給予益母草顆粒4.3 g/kg灌胃)，桃紅四物湯低劑量(4.5 g/kg，相當(dāng)于成人臨床用量的5倍)、中劑量(9.0 g/kg)、高劑量(18.0 g/kg)組，每組8只。正常對照組給予蒸餾水灌胃。大鼠自由飲食，灌胃容積為10 mL/kg，每日2次，連續(xù)7 d。

2.3 子宮組織采集 末次給藥1 h后，用3.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取出子宮組織拍照后，取其中一半用10%多聚甲醛固定，經(jīng)過脫水、石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，觀察大鼠的子宮形態(tài)學(xué)改變；另一半子宮組織于-80 ℃凍存，用于PTEN mRNA及PTEN蛋白檢測。

2.4 PTEN mRNA檢測 從凍存管中取0.1 g子宮組織，冰水浴中研磨均勻，加入1 mL Trizol按說明書提取子宮RNA。260 nm/280 nm下測定純度，滿意后取樣品RNA 5 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按說明書配制總?cè)莘e為20 μL的實時PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；42個PCR循環(huán)(95 ℃，10 s；60 ℃，30 s；72 ℃，1 min)。采用2-ΔΔCt法(ΔCt=待測樣品目的基因Ct值-待測樣品內(nèi)參的Ct值；ΔΔCt=實驗組ΔCt-對照組ΔCt)[11]計算各組大鼠子宮組織的PTEN mRNA相對表達(dá)水平。

2.5 PTEN蛋白檢測 取各組大鼠子宮組織，加裂解液后冰上裂解、研磨，4 ℃下12 000 r/min離心后取上清，考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量。煮沸變性、電泳分離后，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉PBST緩沖液室溫封閉2 h，加PTEN單抗(1∶500)，4 ℃過夜。過夜后PBST洗膜3次，每次10 min，然后與結(jié)合有辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBS洗膜3次，每次10 min，按照ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒使用說明書檢測蛋白表達(dá)水平，并使用凝膠成像系統(tǒng)記錄拍照，Image J檢測各條帶平均灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值之比作為目的蛋白的相對表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 桃紅四物湯對大鼠子宮形態(tài)的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠子宮色澤較暗，有水腫感，各給藥組子宮的色澤較模型組紅潤。見圖1。HE染色后光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：正常對照組子宮內(nèi)膜腺體較大，間質(zhì)無水腫，無充血，管腔內(nèi)無紅細(xì)胞聚集；模型組子宮內(nèi)膜腺體較小，間質(zhì)稍顯水腫，有充血，管腔內(nèi)有紅細(xì)胞聚集；各藥物組子宮間質(zhì)充血和水腫等“血瘀證”表現(xiàn)較模型組減輕。見圖2。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.陽性對照組；D.桃紅四物湯低劑量組；E.桃紅四物湯中劑量組；F.桃紅四物湯高劑量組

圖1各組大鼠子宮的大體形態(tài)

注:A.正常對照組;B.模型組;C.陽性對照組;D.桃紅四物湯低劑量組;E.桃紅四物湯中劑量組;F.桃紅四物湯高劑量組圖2 光鏡下各組大鼠子宮的組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色,10×10倍)

3.2 桃紅四物湯對大鼠子宮PTEN mRNA表達(dá)水平的影響 與正常對照組比較，模型組PTEN mRNA表達(dá)水平顯著升高(t=-2.413，P=0.037)；除正常對照組外，單因素方差分析顯示其他5組PTEN mRNA表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.946，P=0.047)；均數(shù)多重比較發(fā)現(xiàn)，僅桃紅四物湯高劑量組PTEN mRNA表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠子宮PTEN mRNA相對表達(dá)水平比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 桃紅四物湯對大鼠子宮PTEN蛋白表達(dá)水平的影響 與正常對照組比較，模型組PTEN蛋白表達(dá)水平顯著升高(t=-2.134，P=0.048)；除正常對照組外，單因素方差分析顯示其他5組PTEN蛋白表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.931，P=0.049)；均數(shù)多重比較發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯高、中劑量組PTEN表達(dá)水平均顯著低于模型組(P<0.05)。見圖3與圖4。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.陽性對照組；D.桃紅四物湯低劑量組；E.桃紅四物湯中劑量組；F.桃紅四物湯高劑量組

圖3 Western blot法檢測大鼠子宮PTEN蛋白表達(dá)水平

注：A.正常對照組；B.模型組；C.陽性對照組；D.桃紅四物湯低劑量組；E.桃紅四物湯中劑量組；F.桃紅四物湯高劑量組；與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

桃紅四物湯能顯著改善產(chǎn)后血瘀狀態(tài)[2-3,12]，但桃紅四物湯祛瘀生新的作用機(jī)制尚未完成闡明。文獻(xiàn)研究提示，介于Rho/ROCK與PI3K/Akt通路之間的PTEN，可能會在桃紅四物湯祛瘀生新中發(fā)揮橋梁作用[4-6]。本研究率先探索桃紅四物湯治療產(chǎn)后血瘀證的作用機(jī)制與PTEN的關(guān)聯(lián)性。

研究結(jié)果顯示，桃紅四物湯對產(chǎn)后血瘀證有良好治療作用，桃紅四物湯低、中、高劑量組大鼠子宮充血、水腫等“血瘀”狀態(tài)較正常對照組明顯減輕，桃紅四物湯中、高劑量組的作用更為顯著。本研究發(fā)現(xiàn)，模型對照組大鼠子宮組織PTEN mRNA和蛋白表達(dá)水平較正常對照組顯著升高(P<0.05)，各給藥組大鼠子宮組織PTEN mRNA和蛋白的表達(dá)水平較模型組明顯下降，其中桃紅四物湯高劑量組PTEN mRNA和蛋白的表達(dá)水平與模型組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。研究結(jié)果與預(yù)期實驗結(jié)果基本一致，即桃紅四物湯治療產(chǎn)后血瘀的機(jī)制可能與其減少Rho/ROCK信號通路下游PTEN的表達(dá)，從而減弱PTEN對PI3K/Akt通路的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖等有關(guān)[13]。

中醫(yī)認(rèn)為血瘀是婦科疾病最主要的病因，產(chǎn)后血瘀不僅是一種病證也是其他疾病的病因，桃紅四物湯是祛瘀生新的代表方，祛瘀為本，輔以行氣活血，其中桃仁、紅花散瘀活血，當(dāng)歸、熟地黃滋陰養(yǎng)血，白芍養(yǎng)血，川芎調(diào)暢氣血、行氣活血。臨床研究表明，桃紅四物湯對婦科血瘀證有明顯的治療作用[12,14]。

本研究主要從分子生物學(xué)的角度初步探討桃紅四物湯對產(chǎn)后血瘀大鼠的祛瘀生新作用機(jī)制是否與PTEN有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯能改善產(chǎn)后血瘀大鼠子宮的血瘀狀態(tài)，且可能影響PTEN mRNA及PTEN蛋白的表達(dá)，提示桃紅四物湯對產(chǎn)后血瘀大鼠祛瘀生新的作用機(jī)制可能與抑制PTEN蛋白及其基因表達(dá)有關(guān)。