李斯亮，唐 巍，龔 麗，昝興淳，豐麗媛，童明月，何 鵬

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，安徽 合肥 230012)

缺血性腦卒中可產(chǎn)生臨床各種神經(jīng)功能缺失的癥狀，是由于局部腦組織血液供應(yīng)障礙，腦組織缺血低氧性病變壞死所致[1]。該病發(fā)病率、病死率高，每年導(dǎo)致約670萬人死亡[2]。85歲以上老人發(fā)生腦卒中的概率約為25%，缺血性腦卒中約占80%[3]。近年來有研究表明，腦梗死周圍皮質(zhì)的血管生成作用可在一定程度上促進(jìn)腦卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)[4]。電針可增加梗死區(qū)腦血流量、血管數(shù)量，并改善神經(jīng)功能[5]。過去很多報道著眼于減少腦缺血性疾病的損害因素[6]，然而臨床療效并不理想，因此尋求新的方法成為研究的重點(diǎn)。有文獻(xiàn)報道通過抑制內(nèi)皮抑素(endostatin，ES)、血小板反應(yīng)蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)等抑制因子對血管新生的負(fù)向調(diào)節(jié)，能夠改善腦缺血損傷后腦血管生成效應(yīng)，增加缺血區(qū)及其周圍血液供應(yīng)，使受損神經(jīng)得到修復(fù)[7]，這可能成為臨床通過調(diào)控血管新生抑制因子促進(jìn)腦缺血后血管新生，發(fā)揮腦保護(hù)作用的新途徑。本研究以電針與血管新生抑制因子表達(dá)的關(guān)聯(lián)性作為切入點(diǎn)，探討電針療法能否通過調(diào)控血管新生抑制因子的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)功能的改善，產(chǎn)生腦保護(hù)作用。

1 材料

1.1 動物 健康的雄性SD大鼠54只，體質(zhì)量為280～320 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物飼養(yǎng)中心[生產(chǎn)許可證號為SCXK(皖)2011-002]提供。每籠飼養(yǎng)3只，室溫控制在20～25 ℃，保持通風(fēng)，動物在自然條件下飲食飲水，術(shù)前禁食不禁水。

1.2 試劑 ES、TSP-1抗體：武漢Abcam公司；SABC試劑盒：武漢博士德公司；SP二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TTC染色液：美國Sigma公司；ECL顯影劑：Bio-rad公司；SDS：Sigma公司。

1.3 儀器 華佗牌毫針、華佗牌SDZ-Ⅳ型電子針療儀(0.30 mm×25 mm)：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；石蠟組織薄片切片機(jī)：德國LEICA公司；BX51型Olympus顯微鏡：日本Olympus公司；垂直板電泳槽(24DN型)：北京六一儀器廠；EPS300型電泳儀：上海天能科技有限公司。

2 方法

2.1 干預(yù)方法 依據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]進(jìn)行穴位定位，電針組大鼠取“百會”和“水溝”穴進(jìn)行治療?！鞍贂毖ㄈ∮陧敼钦校仄は蚯捌酱? cm；“水溝”穴取于唇裂鼻尖下1 mm正中，沿鼻中隔方向斜刺0.3～0.4 cm。于術(shù)后4 h開始刺激，采用0.30 mm×25 mm毫針針刺，接SDZ-Ⅳ華佗電針治療儀。電針參數(shù)為疏密波，電流強(qiáng)度為1 mA，頻率為2 Hz。每次時間30 min，每日1次，連續(xù)治療7 d。

2.2 動物分組及模型制備 54只大鼠分為假手術(shù)組、模型組、電針組，每組18只。參照LONGA等[9]改良的頸外動脈線栓法復(fù)制局灶性大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型：大鼠術(shù)前禁食不禁水，用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉(10 mL/kg)，仰臥位固定于鼠板，無菌操作。用手術(shù)剪在頸部正中靠右0.5 cm處縱向剪一道長約2 cm的切口，血管鉗鈍性分離，暴露右側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)和迷走神經(jīng)。向下剝離出頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)和頸外動脈(external carotid artery，ECA)，用縫合線在ECA上打死結(jié)并將其在遠(yuǎn)心端凝斷，使ECA的游離端與ICA拉成一條直線，動脈夾暫時夾閉備用線遠(yuǎn)端的ICA和CCA。在ECA根部用縫合線打一松結(jié)，再用眼科剪在ECA殘端斜45°方向剪一小口，將適合于大鼠體質(zhì)量標(biāo)記好的魚線插入ICA并沿入顱方向徐徐推入，插入深度18～20 mm，稍遇阻力應(yīng)立即停止插線。將ECA根部預(yù)留好的縫合線打死結(jié)固定好，移去動脈夾，縫合切口皮膚，常規(guī)無菌操作后注射0.5 mL青霉素鈉，預(yù)防感染。其中假手術(shù)組不插入栓線，僅作各動脈分離。大鼠清醒后自由進(jìn)食、進(jìn)水，每日更換墊料，保持籠具清潔，注意保溫。依據(jù)神經(jīng)功能學(xué)評分判斷大鼠模型是否復(fù)制成功[10]，模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)：對側(cè)前爪彎曲，伸展受限；自主運(yùn)動時，身體向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈或者身體向?qū)?cè)傾倒。

2.3 神經(jīng)功能學(xué)評分 參照文獻(xiàn)[11]制定神經(jīng)功能評分標(biāo)準(zhǔn)。于大鼠清醒后評分。0分：大鼠自主活動無異常；1分：大鼠左側(cè)前肢伸展不全；2分：大鼠醒后運(yùn)動時，向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：大鼠醒后運(yùn)動時，身體向左側(cè)傾倒；4分：意識喪失，不能自發(fā)行走。

2.4 指標(biāo)觀察方法

2.4.1 大鼠神經(jīng)功能評分 參考神經(jīng)功能學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)，于治療7 d后對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。

2.4.2 大鼠腦梗死面積檢測 利用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-Triphenyte-trazoliumchloride，TTC)染色法進(jìn)行觀察。大鼠評分結(jié)束立刻予以腹腔深度麻醉處死，快速取完整腦組織置于冰袋上，用生理鹽水沖凈后立即置于培養(yǎng)皿中，切除小腦和嗅球。放入-20 ℃冰箱10～15 min冰凍，取出后進(jìn)行冠狀面切片，共5片，每片厚度為2 mm。加入2% TTC染色液，于37 ℃水浴箱中避光溫育30 min，4 ℃環(huán)境下用4%多聚甲醛固定。將腦片取出擺放好，用數(shù)碼相機(jī)照像。用圖像分析系統(tǒng)Image Pro-Plus 6.0測量腦梗死面積，腦梗死面積百分比=梗死面積/全腦片面積×100%。

2.4.3 大鼠腦缺血皮質(zhì)區(qū)ES、TSP-1蛋白表達(dá)水平檢測 用4%多聚甲醛將全腦固定過夜，1周后取出，經(jīng)過脫水、浸蠟、包埋、切片、攤片、烤片及脫蠟等步驟，采用免疫組織化學(xué)法對腦組織中ES、TSP-1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。隨機(jī)選取7張非連續(xù)的腦組織切片，在400倍光鏡下觀察缺血梗死部位，采用Image pro-plus 6.0圖像處理系統(tǒng)計平均光密度，以胞漿棕黃色為陽性表達(dá)。

2.4.4 大鼠腦缺血皮質(zhì)區(qū)ES、TSP-1蛋白相對表達(dá)水平檢測 采用Western blot法進(jìn)行測定。用RIPA裂解液提取蛋白，按照1∶4加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。ES、TSP-1分別進(jìn)行10% SDS-PAGE、15% SDS-PAGE變性電泳，轉(zhuǎn)膜后再用TBST(含5%脫脂奶粉)封閉，而后進(jìn)行一抗孵育、二抗孵育。TBST洗膜后，參照ECL發(fā)光試劑盒說明書依次進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影、定影。用Image J軟件計算內(nèi)參條帶與目標(biāo)條帶的凈吸光度值，最終得出目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶凈吸光度值的比值作為蛋白相對表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 假手術(shù)組大鼠無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，評分為0分；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀較為明顯；與模型組比較，電針組大鼠經(jīng)電針干預(yù)后神經(jīng)功能缺損評分明顯降低(P<0.05)。結(jié)果提示電針療法可有效提高腦缺血大鼠的神經(jīng)功能。見圖1。

3.2 各組大鼠腦梗死面積比較 經(jīng)TTC染色觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組未見明顯缺血區(qū)域，模型組右側(cè)腦半球出現(xiàn)蒼白色缺血區(qū)域。經(jīng)過計算梗死面積發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死區(qū)域明顯；與模型組比較，電針組大鼠梗死面積顯著減小(P<0.05)。見圖1、圖2。

3.3 各組大鼠腦缺血皮質(zhì)區(qū)ES、TSP-1陽性細(xì)胞平均光密度比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦缺血皮質(zhì)區(qū)ES、TSP-1陽性細(xì)胞平均光密度明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，電針組ES、TSP-1陽性細(xì)胞平均光密度明顯降低(P<0.05)。見圖3、圖4。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.電針組；與模型組比較，△P<0.05；神經(jīng)功能缺損評分，n=18;腦梗死面積,n=6

圖2 各組大鼠腦梗死區(qū)域大體形態(tài)(TTC染色)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

3.4 各組大鼠腦缺血皮質(zhì)區(qū)ES和TSP-1蛋白表達(dá)水平比較 假手術(shù)組大鼠腦缺血皮質(zhì)區(qū)ES、TSP-1蛋白有少量表達(dá)；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠ES、TSP-1蛋白表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)；與模型組比較，電針組ES、TSP-1蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。見圖5。

4 討論

腦缺血屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇。其病機(jī)可歸納為風(fēng)、火、痰、氣、虛、瘀，機(jī)體可在此6種病因影響下導(dǎo)致陰陽失調(diào)，氣血逆亂，上犯于腦而發(fā)病。針刺作為傳統(tǒng)中醫(yī)療法，具有操作簡便、安全的特點(diǎn)，在腦缺血治療及其后遺癥預(yù)防方面卓有成效?！鞍贂睘槭肿闵訇枴⒆闾?、足厥陰與督脈之會，有疏通腦絡(luò)、協(xié)調(diào)百脈、補(bǔ)神益智之效。“水溝”系督脈穴，為督脈與手足陽明經(jīng)的交會穴，可開竅啟閉、調(diào)督醒神。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，針刺“百會”“水溝”可發(fā)揮對腦缺血后損傷的修復(fù)作用[12-14]。故本實(shí)驗(yàn)選取此二穴對MCAO模型大鼠進(jìn)行電針干預(yù)，探討其相關(guān)作用機(jī)制。

圖4 各組大鼠腦缺血皮質(zhì)區(qū)ES、TSP-1陽性細(xì)胞表達(dá)比較(免疫組織化學(xué)法，10×40倍，箭頭示陽性細(xì)胞)

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.電針組；與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

腦缺血發(fā)生后，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷可導(dǎo)致血腦屏障功能障礙，降低其通透性，形成腦水腫；腦水腫可進(jìn)一步損傷缺血區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞[15]。文獻(xiàn)報道，新生的腦微血管可改善缺血區(qū)周圍的血流灌注，為修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞提供良好的微環(huán)境，改善腦缺血后的神經(jīng)功能[16]。

研究發(fā)現(xiàn)，ES是目前已知最強(qiáng)的內(nèi)源性血管生成抑制因子，能特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制遷移活動，從而抑制血管再生[17]。ES主要在一些高度血管化的組織(如腦的脈絡(luò)膜、腸壁血管)中表達(dá)，并參與血管周邊基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和組裝[18]，在正常腦組織呈低表達(dá)，腦缺血損傷后主要表達(dá)在海馬、側(cè)腦室周圍、紋狀體等部位，并于腦缺血后2 h增加，12 h達(dá)高峰[19]。另有研究發(fā)現(xiàn)，ES可導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與其受體的結(jié)合減少，抑制VEGF介導(dǎo)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)酪氨酸磷酸化，從而抑制VEGF誘導(dǎo)的新血管形成作用[20]。TSP-1是一種血管生成抑制因子[21]，主要通過刺激炎性因子和DR相關(guān)基因的表達(dá)誘導(dǎo)一氧化氮合酶等效應(yīng)蛋白的表達(dá)來發(fā)揮作用，可抑制纖維生長因子或VEGF誘導(dǎo)的血管生成反應(yīng)，通過多種途徑抑制內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，阻礙其遷移[22]。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)烈的血管新生促進(jìn)因子[23]。研究表明，通過上調(diào)梗死區(qū)VEGF的表達(dá)、下調(diào)ES的表達(dá)有利于血管新生，可改善缺血區(qū)周圍血流灌注，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)。資料顯示，腦缺血損傷修復(fù)的關(guān)鍵之一是調(diào)整ES和VEGF兩者之間的動態(tài)平衡[24]，而電針下調(diào)TSP-1的表達(dá)亦可對腦缺血損傷起到修復(fù)作用[25]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電針干預(yù)可明顯改善大鼠神經(jīng)功能，有效降低缺血區(qū)梗死面積，同時可伴有血管新生抑制因子ES、TSP-1蛋白表達(dá)下降。電針干預(yù)能夠抑制ES、TSP-1等血管新生抑制因子對血管新生的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，從而發(fā)揮VEGF等血管新生促進(jìn)因子的血管生成作用，修復(fù)受損神經(jīng)，減輕腦缺血后腦神經(jīng)的損傷。

綜上所述，電針“百會”和“水溝”穴可顯著下調(diào)MCAO模型大鼠腦缺血皮質(zhì)區(qū)血管新生抑制因子ES、TSP-1蛋白表達(dá)，這對于促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，縮小缺血區(qū)梗死面積，具有一定的臨床價值，可能是其發(fā)揮腦缺血后腦功能保護(hù)作用的機(jī)制之一。而ES、TSP-1對缺血性腦卒中后血管新生的作用機(jī)制尚未明確，有待于進(jìn)一步研究。