王神香，高吳陽(yáng)，熊少兵，熊云鶴，汪前亮

(1.三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院泌尿外科，湖北宜昌 443000；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430060)

先天性膀胱異常、感染、浸潤(rùn)性膀胱腫瘤、膀胱外傷等上述疾病往往需要進(jìn)行膀胱擴(kuò)大成形手術(shù)或者膀胱替代治療。目前臨床上進(jìn)行膀胱擴(kuò)大成形手術(shù)或者膀胱替代的金標(biāo)準(zhǔn)為使用腸道進(jìn)行膀胱擴(kuò)大或尿流改道術(shù)[1]。但是，由于胃腸道組織與膀胱組織在結(jié)構(gòu)和功能上存在明顯差異，用胃腸道組織修復(fù)膀胱并不是理想的方法，多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道了腸管代膀胱常常伴隨各種并發(fā)癥的發(fā)生[2]，如慢性反復(fù)的尿路感染、水電解質(zhì)失衡、代膀胱吻合口狹窄、繼發(fā)惡性腫瘤、腸道黏液分泌以及結(jié)石形成等[3-4]。組織工程學(xué)的發(fā)展為膀胱組織的修復(fù)或重建帶來了希望，通過組織工程的方法構(gòu)建具有類似膀胱組織結(jié)構(gòu)的組織工程復(fù)合物進(jìn)行膀胱修補(bǔ)，則可能避免上述問題。

尿路上皮層是被覆在膀胱腔內(nèi)的具有防止尿液滲漏以及執(zhí)行黏膜免疫功能的重要屏障[5]，是尿路結(jié)構(gòu)與其他組織最重要的區(qū)別所在。但是尿路上皮細(xì)胞作為一種分化成熟的細(xì)胞，在體外培養(yǎng)環(huán)境下難以大量擴(kuò)增[6]。目前已有多項(xiàng)研究證明脂肪干細(xì)胞在體外環(huán)境下可以向尿路上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化[7]。本研究擬誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向尿路上皮細(xì)胞分化，并將誘導(dǎo)后細(xì)胞與小腸黏膜下層(small intestinal submucosa,SIS)復(fù)合，評(píng)價(jià)細(xì)胞與支架材料的生物相容性，為進(jìn)一步構(gòu)建組織工程化組織提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性新西蘭大白兔6只，兔齡8周，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，購(gòu)自湖北省預(yù)防疾控中心。所有動(dòng)物處置均嚴(yán)格按照倫理審查標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.1.2主要試劑 Ⅰ型膠原酶、胰酶、小牛血清、DMEM、雙抗、Percoll、KSFM培養(yǎng)基(Gibco公司)，抗UP1a抗體、抗CK-18抗體(Santa cruz公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記CD31、 FITC標(biāo)記CD45、FITC標(biāo)記CD29、FITC標(biāo)記CD44(英國(guó)Abcam公司)，山羊抗小鼠熒光二抗(武漢谷歌生物科技有限公司)。其中尿路上皮細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2方法

1.2.1兔脂肪干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 新西蘭兔進(jìn)行耳緣靜脈麻醉。組織剪剪去腹股溝兔毛，用1%的消毒碘消毒腹股溝區(qū)皮膚，取無血管的脂肪組織20 g立即放置于含青霉素—鏈霉素的磷酸鹽緩沖液中。在層流超凈工作臺(tái)用無菌的眼科剪將上述脂肪組織完全剪成碎末狀。移至無菌離心管，加入濃度為0.1%的I型膠原酶進(jìn)行消化，50 min后加入配置好的含胎牛血清的相同體積的L-DMEM培養(yǎng)基終止消化過程；通過目網(wǎng)(100和200)過濾后，將得到的濾過液移至無菌離心管中，以1 500 r/min 離心5 min，去掉上清液，PBS重懸，離心5 min，重復(fù)上述操作2次，最后用DMEM重懸制作細(xì)胞懸液。轉(zhuǎn)入10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，置入37 ℃，飽和濕度的體積分?jǐn)?shù)為5%的 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。隨后間隔2 d換液，7～10 d細(xì)胞80%左右融合即可常規(guī)胰酶消化傳代。

1.2.2兔ADSCs的流式鑒定方法 選取第3代ADSCs，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞融合達(dá)到90%時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，并向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入0.25%的胰酶消化液(含有0.04% EDTA)，消化時(shí)間1～2 min，待細(xì)胞完全脫離瓶壁后，用等體積DMEM終止消化，1 500 r/min，離心5 min，棄上清，加入流式緩沖液離心后再次重懸，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。取3×104細(xì)胞/mL，用4%的多聚甲醛固定30 min,使用流式緩沖液沖洗細(xì)胞2遍，每次1 min，離心后加入含有CD29、CD31、CD45、CD44一抗的流式緩沖液，在4 ℃條件下孵育1 h后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物。

1.2.3脂肪干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 研究中選擇Transwell共培養(yǎng)小室模型，Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)由corning公司生產(chǎn)，分為上、下兩室，兩室之間由膜慮器隔開，膜慮器主要由一種聚碳酸酯膜構(gòu)成，有不同孔徑類型，3 μm以下的孔徑細(xì)胞無法自由通過，而細(xì)胞因子等小分子物質(zhì)可以自由通過。脂肪干細(xì)胞傳代到第3代，實(shí)驗(yàn)過程中，將脂肪干細(xì)胞懸液以1×105/cm2密度種植于Transwell 共培養(yǎng)系統(tǒng)的下層，所用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基[含1%雙抗，10%(V/V)胎牛血清，低糖DMEM培養(yǎng)基]。同時(shí)將尿路上皮細(xì)胞以2×105/cm2種植于小室的上層，加入KSFM培養(yǎng)基，并設(shè)置下層種植脂肪干細(xì)胞，上層不種任何細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。完成細(xì)胞分層種植后，將Transwell小室系統(tǒng)放置于37 ℃、CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱，間接共培養(yǎng)2周時(shí)間。

1.2.4小腸黏膜下層的制備方法 用手術(shù)方法取出兔的小腸，置于10 mmol/L PBS和0.1%疊氮鈉的混合溶液中浸泡，攪拌過夜，并用薄玻片刮去小腸黏膜層。然后將包有紗布的血管鉗揉搓的方式去除肌層及漿膜層組織，剩下小腸黏膜下層組織，PBS洗滌后繼續(xù)用0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)和0.4%胰蛋白酶混合溶液在 37 ℃條件下浸泡攪拌5～10 h。用保護(hù)液(1%甲醛+ 0.2% 戊二醛保護(hù)液)交聯(lián)保護(hù)10 min。PBS漂洗后，用 1 mol/L NaCl加40 U/mL DNase溶液于37 ℃攪拌6～ 8 h。最后用4%脫氧膽酸鈉和0.1%疊氮鈉溶液浸泡和攪拌5～6 h，此過程必要時(shí)需重復(fù)1次。取少量制備的小腸黏膜下層組織進(jìn)行蘇木精-伊紅染色及掃描電鏡觀察脫細(xì)胞效果，其余置于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中消毒30 min， 冷凍干燥后密封，環(huán)氧乙烷消毒以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5誘導(dǎo)后脂肪干細(xì)胞種植于SIS復(fù)合培養(yǎng)及細(xì)胞相容性評(píng)估 取在Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)誘導(dǎo)分化14 d后的誘導(dǎo)后細(xì)胞，利用胰酶消化貼壁細(xì)胞，10%的胎牛血清中和后進(jìn)行離心5 min，再用DMEM重懸，并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)到4×106/mL，在超凈工作臺(tái)上將上述密度的細(xì)胞懸液緩慢滴加于SF/CS支架一面，逐滴加入蓋滿整個(gè)支架材料，然后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，促使誘導(dǎo)后細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，取出上述培養(yǎng)皿，在超凈工作臺(tái)中向培養(yǎng)皿繼續(xù)加入DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基加到以剛好浸沒支架材料，立即停止滴注，小心將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2 d換液一次。

將兔SIS剪成直徑約1 cm的圓形小塊12 塊，PBS清洗2次后置入24孔板的其中12孔內(nèi)，加 DMEM/F12完全培養(yǎng)基孵育48 h。將誘導(dǎo)后細(xì)胞以1.0×109/L的濃度接種到置有SIS的12孔內(nèi)，其余12孔加等量同期培養(yǎng)的誘導(dǎo)后細(xì)胞作為對(duì)照，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從培養(yǎng)第2 d起每天各取每組的1孔消化離心進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)12 d。據(jù)兩組所得細(xì)胞數(shù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，對(duì)比兩組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.6主要觀察指標(biāo) ①倒置顯微鏡下觀察第3代脂肪干細(xì)胞形態(tài)，流式檢測(cè)第3代脂肪干細(xì)胞的表面標(biāo)記物；②細(xì)胞免疫熒光和Western blot 對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)后效果進(jìn)行檢測(cè)；③檢測(cè)小腸黏膜下層脫細(xì)胞情況；④掃描電鏡和組織學(xué)檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞和SIS復(fù)合培養(yǎng)狀況；⑤觀察分析誘導(dǎo)后細(xì)胞和SIS復(fù)合培養(yǎng)后的生長(zhǎng)曲線圖。

2 結(jié) 果

2.1脂肪干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及流式細(xì)胞鑒定本實(shí)驗(yàn)通過膠原酶消化法成功分離出ADSCs，6 h出現(xiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，24 h后細(xì)胞貼壁數(shù)目明顯增多；2 d后細(xì)胞形態(tài)多樣，表現(xiàn)為圓形、多角形、長(zhǎng)梭形等不一；3 d后以長(zhǎng)梭狀細(xì)胞形態(tài)為主，可見少量不規(guī)則細(xì)胞(圖1A)，每2 d換液一次，原代細(xì)胞生長(zhǎng)速度較緩慢，一般需要培養(yǎng)7 d，細(xì)胞的相互融合度才能達(dá)到80%，而到第10 d，細(xì)胞融合度可達(dá)到90%，倒置鏡下觀察可見細(xì)胞呈典型的紡錘樣形態(tài)，形成多個(gè)細(xì)胞集落并相互融合，細(xì)胞形態(tài)均一(圖1B)。經(jīng)初次按1∶2比例傳代后，傳代后細(xì)胞增殖速度較原代細(xì)胞明顯加快，傳代細(xì)胞培養(yǎng)4～5 d即可達(dá)到80%細(xì)胞融合度，傳代過程有純化細(xì)胞能力，經(jīng)傳代后脂肪干細(xì)胞的純度提高，傳至第3代細(xì)胞獲得了較高的純化，脂肪干細(xì)胞連續(xù)傳代至第10代仍然保持較好的增殖狀態(tài)。

圖1 ADCSs原代培養(yǎng)

經(jīng)傳代培養(yǎng)，獲取P3代純化的細(xì)胞，用于流式術(shù)檢測(cè)表面抗原CD分子，結(jié)果顯示，細(xì)胞高表達(dá)CD29 (99.6%)、CD44 (98.2%)；低表達(dá)CD31 (1.9%)、CD45(1.6%)(圖2)。上述流式結(jié)果與間充質(zhì)干細(xì)胞的表型相符合，證明我們成功獲取的是ADSCs細(xì)胞，排除了造血干細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞。

圖2 ADCSs流式細(xì)胞術(shù)鑒定直方圖

A：ADCSs 細(xì)胞表面標(biāo)志CD29 99.6%;B：ADCSs 細(xì)胞表面標(biāo)志CD44 98.2%;C：ADCSs 細(xì)胞表面標(biāo)志CD31 1.9%;D：ADCSs 細(xì)胞表面標(biāo)志CD45 1.6%。

2.2誘導(dǎo)分化后細(xì)胞的特征及表型鑒定為進(jìn)一步確認(rèn)ADSCs誘導(dǎo)后分化的效果，本實(shí)驗(yàn)中通過免疫熒光檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞尿路上皮細(xì)胞特異性蛋白UPIa的表達(dá)，將誘導(dǎo)后細(xì)胞爬片行免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果提示：未誘導(dǎo)分化的ADSCs不表達(dá)特異性UPIa蛋白(圖3A、B)，而進(jìn)行共培養(yǎng)誘導(dǎo)后細(xì)胞可出現(xiàn)UPIa的表達(dá)(圖3C、D)。通過Western Blot檢測(cè)尿路細(xì)胞特異性蛋白UPIa的表達(dá)水平，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，誘導(dǎo)后細(xì)胞的尿路上皮細(xì)胞特異性蛋白UPIa表達(dá)上調(diào)，而未誘導(dǎo)的ADSCs這兩種特異性蛋白呈低表達(dá)狀態(tài)(圖4)，結(jié)果與免疫熒光的結(jié)果相符。上述這些結(jié)果表明，脂肪干細(xì)胞在共培養(yǎng)體系的誘導(dǎo)下，誘導(dǎo)后的細(xì)胞已向尿路上皮細(xì)胞分化，具有尿路上皮的表型。

圖3未誘導(dǎo)的ADSCs和誘導(dǎo)后細(xì)胞(ISCs)UPIa蛋白表達(dá)情況(×200)

A:未誘導(dǎo)分化的ADSCs胞質(zhì)不表達(dá)特異性UPIa蛋白；B：DAPI顯示未誘導(dǎo)分化的ADSCs胞核；C：誘導(dǎo)后細(xì)胞胞質(zhì)可出現(xiàn)UPIa的表達(dá)；D：DAPI顯示誘導(dǎo)分化的ADSCs胞核。

圖4Westernblot顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞(ISCs)表達(dá)UPIa

2.3兔小腸黏膜下層(SIS)的組織學(xué)觀測(cè)結(jié)果SIS呈白色半透明狀，蘇木精-伊紅染色顯示未見細(xì)胞核的殘留，細(xì)胞外基質(zhì)依然保持波浪狀的纖維形態(tài)，且能繼續(xù)維持相互交聯(lián)的狀態(tài)(圖5A)。Masson染色未見明顯的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，藍(lán)染的纖維樣結(jié)構(gòu)同HE染色相似，亦呈現(xiàn)出波浪分布、縱橫交錯(cuò)的現(xiàn)象(圖5B)。電鏡下觀察SIS，SIS表面未見明顯的細(xì)胞殘留，而可見大量的纖維樣組織交錯(cuò)分布，形成一種三維立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。纖維樣基質(zhì)相互交織成孔隙樣結(jié)構(gòu)(圖5C)。

圖5腸管脫細(xì)胞處理后無細(xì)胞殘留

A：SIS蘇木精-伊紅染色呈紅色細(xì)絲狀，內(nèi)無細(xì)胞殘余(×100)；B：Masson染色(×200)；C：掃描電鏡下觀，可見交錯(cuò)排列成網(wǎng)狀的白色膠原纖維，未見細(xì)胞碎裂殘片。

2.4掃描電鏡和組織學(xué)檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞和SIS復(fù)合培養(yǎng)情況兔誘導(dǎo)后脂肪干細(xì)胞可成功種植于SIS上，倒置顯微鏡下可見SIS邊緣有細(xì)胞爬出，SIS周邊有大量細(xì)胞生長(zhǎng)。行蘇木精-伊紅染色可見細(xì)胞散在分布于SIS表面，細(xì)胞核染色呈藍(lán)色(圖6A)。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后細(xì)胞能夠均勻地平鋪于SIS上，細(xì)胞在支架表面融合良好，能夠較好地黏附于支架材料上(圖6B)。

2.5誘導(dǎo)后細(xì)胞與SIS的生物相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線基本相似，種植后3 d內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線相對(duì)平緩，可能為細(xì)胞的適應(yīng)期，而4～10 d生長(zhǎng)曲線變陡峭，細(xì)胞呈倍數(shù)分裂生長(zhǎng)，11～12 d曲線又趨于平緩，可能為細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到飽和狀態(tài)，互相之間產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制。從繪制的生長(zhǎng)曲線可推斷誘導(dǎo)后細(xì)胞在SIS表面能夠很好地粘附、增殖及分裂生長(zhǎng)，說明誘導(dǎo)后細(xì)胞在SIS表面生長(zhǎng)良好，兩者相容性較好(圖7)。

圖6 SIS負(fù)載誘導(dǎo)后細(xì)胞

A：SIS負(fù)載誘導(dǎo)后細(xì)胞的HE染色(×200)；B：SIS負(fù)載誘導(dǎo)后細(xì)胞的掃描電鏡觀察(×1 000)。

圖7 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組誘導(dǎo)后細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線圖

3 討 論

構(gòu)建組織工程化組織主要涉及到兩個(gè)核心問題：種子細(xì)胞和支架材料。目前應(yīng)用于泌尿系組織工程的細(xì)胞主要是來自自體器官的特異性細(xì)胞：尿路上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。自體尿路上皮細(xì)胞和SMCs細(xì)胞用于泌尿系組織工程的相關(guān)研究較多，包括基礎(chǔ)研究和臨床研究[8]，有研究者用胰酶消化的方法獲得尿路上皮細(xì)胞[9]，經(jīng)體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，然后與SIS支架復(fù)合制成細(xì)胞-支架復(fù)合移植物，再植入兔皮下觀察復(fù)合物生物相容性，術(shù)后取組織標(biāo)本觀察組織再生情況，同時(shí)行免疫組化了解尿路上皮的增殖情況，研究表明尿路上皮構(gòu)建組織工程可以獲得較好的效果。在臨床應(yīng)用方面取得了一定成果，在2006年，ATALA[10]用膀胱穿刺活檢方法從7例脊髓脊膜突出患兒(4～19歲)膀胱組織獲取尿路上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，并將細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增后種植于膠原支架或膠原-PGA復(fù)合支架構(gòu)建了組織工程化復(fù)合移植物，最后將復(fù)合移植物行膀胱擴(kuò)大成形術(shù)，研究結(jié)果顯示平均膀胱漏尿點(diǎn)壓明顯下降，而膀胱容量及順應(yīng)性增加，術(shù)后無尿結(jié)石形成，穿刺活檢顯示修復(fù)的膀胱結(jié)構(gòu)與正常膀胱組織相似。以上兩種自體種子細(xì)胞避免了與宿主發(fā)生排斥反應(yīng)。采用自體種子細(xì)胞在客觀上是理想的選擇，可以達(dá)到組織再生的要求。但自體細(xì)胞存在以下問題：①成體細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中增殖能力及功能逐漸減弱，出現(xiàn)細(xì)胞老化現(xiàn)象；②對(duì)于膀胱腫瘤的患者，無法獲得高純度的正常膀胱細(xì)胞；③一些先天性泌尿系疾病也可導(dǎo)致無法獲取大量的UCs或SMCs細(xì)胞。因此，找到一種合適的種子細(xì)胞，并能夠適用于組織工程大規(guī)模應(yīng)用的需求是問題的關(guān)鍵。

ADSCs獲取于脂肪組織，同其他眾多的干細(xì)胞不同的是，ADSCs適應(yīng)性強(qiáng)，來源極為豐富，獲取簡(jiǎn)單，增值能力佳。本實(shí)驗(yàn)即采用了膠原酶消化法進(jìn)行了ADSCs的原代培養(yǎng)，也證實(shí)了這種方法的有效性和高效性。通過流式術(shù)檢測(cè)表面抗原CD分子，細(xì)胞高表達(dá)CD29 (99.6%)、CD44 (98.2%)，低表達(dá)CD31 (1.9%)、CD45(1.6%)。上述流式結(jié)果與間充質(zhì)干細(xì)胞的表型相符合，證明我們成功獲取的是ADSCs細(xì)胞，排除了造血干細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞。與其他干細(xì)胞相似的是，ADSCs分化能力強(qiáng)，可分化為多種細(xì)胞系。有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)ADSCs可誘導(dǎo)分化為多種類型的體細(xì)胞，如心肌細(xì)胞[11]、平滑肌細(xì)胞[12]、脂肪細(xì)胞[13]、軟骨細(xì)胞[14]。另外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，ADSCs可誘導(dǎo)向上皮細(xì)胞方向分化。LI等[15]利用體外3D培養(yǎng)系統(tǒng)，通過添加表皮生長(zhǎng)因子、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子等誘導(dǎo)ADSCs向上皮細(xì)胞方向分化，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)后，可以發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)的細(xì)胞展現(xiàn)出分層上皮狀形態(tài)，同時(shí)可以檢測(cè)到上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)，從而證實(shí)了在特定微環(huán)境中ADSCs可被誘導(dǎo)向上皮細(xì)胞方向分化。ZHANG等[16]將ADSCs置入培養(yǎng)過永生化尿路上皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)和通過Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)將ADSCs與永生化尿路上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，兩種方法誘導(dǎo)ADSCs分化21 d，可以檢測(cè)到相關(guān)尿路上皮細(xì)胞蛋白的表達(dá)，因此作者認(rèn)為ADSCs有誘導(dǎo)分化為成熟尿路上皮細(xì)胞的潛力。然而，精確的分子調(diào)控ADSCs向尿路上皮細(xì)胞分化的機(jī)制還處于探索階段。本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)培養(yǎng)ADSCs后通過免疫熒光和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后的細(xì)胞在形態(tài)上向尿路上皮細(xì)胞靠近，并且能夠表達(dá)尿路上皮細(xì)胞特異性蛋白，這不僅證實(shí)了上述ADSCs具有向尿路上皮細(xì)胞方向分化的潛能，也為下一步種子細(xì)胞的種植奠定了基礎(chǔ)。

理想的支架材料應(yīng)該具有生物兼容性，支持細(xì)胞生長(zhǎng)，擁有三維結(jié)構(gòu)，無毒性，可降解，降解產(chǎn)物可吸收，易塑形，有一定的強(qiáng)度，能調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、遷移、增殖和分化，同時(shí)不會(huì)誘導(dǎo)嚴(yán)重的炎性反應(yīng)。SIS是一種天然的、以膠原蛋白為主要成分的細(xì)胞外基質(zhì)，是將小腸組織的黏膜、漿膜及肌層通過機(jī)械作用進(jìn)行脫離后剩下的黏膜下層組織。HURST等[17]通過免疫組化的方法分析SIS支架材料，檢測(cè)出多種生長(zhǎng)因子的存在，包括硫酸類肝素蛋白多糖、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，但轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子并沒有被檢測(cè)出。多項(xiàng)研究顯示SIS能夠較好地支持細(xì)胞增殖，遷移和分化。SHUKLA等[18]分離培養(yǎng)豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并誘導(dǎo)其向尿路SMCs方向分化。其后將分化的細(xì)胞和未進(jìn)行誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種到SIS，將復(fù)合物進(jìn)行自體膀胱擴(kuò)大術(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SIS可較好地支持細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，進(jìn)一步有助于膀胱擴(kuò)大術(shù)中膀胱組織的再生。YANG等[19]研究發(fā)現(xiàn)SIS內(nèi)成分有促進(jìn)人膀胱SMCs和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附、增殖、遷移的作用。

在本實(shí)驗(yàn)中將誘導(dǎo)后的脂肪干細(xì)胞種植于SIS上，通過蘇木精-伊紅染色發(fā)現(xiàn)SIS表面有細(xì)胞生長(zhǎng)，說明細(xì)胞可種植于SIS上。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后細(xì)胞能夠均勻地平鋪于SIS上，細(xì)胞在支架表面融合良好，能夠較好地粘附于支架材料上。進(jìn)一步將SIS剪成小塊置入24孔板的其中12孔內(nèi)，接種誘導(dǎo)后細(xì)胞到24孔板內(nèi)，通過繪制兩組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖，測(cè)得實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線相似，進(jìn)一步說明誘導(dǎo)后細(xì)胞在SIS表面能夠很好地貼附、分裂生長(zhǎng)，二者的組織相容性較好。

總之，本研究探討了脂肪干細(xì)胞向尿路上皮細(xì)胞分化的可行性，誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)尿路上皮細(xì)胞特有標(biāo)記物，具有尿路上皮細(xì)胞表型，可作為構(gòu)建泌尿系組織工程組織的種子細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)一步探討了誘導(dǎo)后細(xì)胞與SIS的生物相容性，通過組織學(xué)檢查和掃描電鏡證實(shí)了細(xì)胞可以在SIS材料上粘附和生長(zhǎng)，且實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組具有相似的生長(zhǎng)曲線，說明SIS有利于促進(jìn)細(xì)胞增殖，無細(xì)胞毒性作用，該項(xiàng)研究為進(jìn)一步構(gòu)建泌尿系組織工程組織奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。