翁 鴻，曾憲濤，黃 橋，高群竣，王行環(huán)

(1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430071；2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院循證與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，湖北武漢 430071；3.武漢大學(xué)循證與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，湖北武漢 430071；4.深圳市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)重編程技術(shù)重點實驗室，廣東深圳 518035；5.深圳市第二人民醫(yī)院泌尿外科，廣東深圳 518035)

膀胱癌是常見惡性腫瘤之一，男性發(fā)病率高于女性，據(jù)世界癌癥研究機構(gòu)2012年的全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，男性中膀胱癌發(fā)病率排第6位，死亡率占第9位[1]。已有大量研究顯示，吸煙、飲酒、職業(yè)暴露、肥胖、體育活動、大氣污染等是膀胱癌發(fā)病的危險因素[2-7]。近年來，我國人群生活方式發(fā)生改變，肥胖率增加，尤其是男性吸煙、飲酒率較高，可能是膀胱癌發(fā)病率上升的影響因素。因此，尋找膀胱癌驅(qū)動基因、早期診斷標(biāo)志物、預(yù)后標(biāo)志物及可能的治療靶點是亟待解決的重要工作。隨著轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，膀胱癌基因組學(xué)數(shù)據(jù)越來越多。因此，本團(tuán)隊從Oncomine數(shù)據(jù)庫中篩選出肌層浸潤性膀胱癌與癌旁組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)并進(jìn)行整合分析，將表達(dá)差異最顯著的基因進(jìn)行后續(xù)分析，旨在尋找膀胱癌發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動基因及可能的診斷及預(yù)后標(biāo)志物和潛在的治療靶點。

1 材料與方法

1.1實驗材料通過Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org)篩選出肌層浸潤性膀胱癌與癌旁組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)(6個子數(shù)據(jù)集)，然后進(jìn)行整合分析，篩選出表達(dá)差異最顯著的基因進(jìn)行后續(xù)分析。然后通過基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載膀胱癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE13507的基因表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)及其臨床病理特征數(shù)據(jù)集[8-9]，用來分析Oncomine中篩選出來的表達(dá)差異最顯著的基因與膀胱癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，并分析其診斷效能。

1.2實驗方法Oncomine數(shù)據(jù)庫采用差異基因分析方法分析膀胱癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選出肌層浸潤性膀胱癌vs.正常組織的子數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，將差異基因進(jìn)行排序。然后將表達(dá)差異最顯著的基因作為目的基因，在GSE13507數(shù)據(jù)集中找到對應(yīng)的探針，然后將該目的基因在GSE13507各樣本中的表達(dá)數(shù)據(jù)提取出來，利用目的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的中位數(shù)進(jìn)行分組，分為目的基因低表達(dá)組和高表達(dá)組。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法目的基因篩選為Oncomine數(shù)據(jù)庫在線自動分析功能，故僅介紹GSE13507數(shù)據(jù)集的后續(xù)統(tǒng)計分析。采用t檢驗檢測目的基因在膀胱癌與癌旁組織中表達(dá)的差異；采用χ2檢驗檢測目的基因高表達(dá)組與低表達(dá)組在膀胱癌臨床病理特征(包括年齡、性別、浸潤、TNM分期、腫瘤復(fù)發(fā)、腫瘤進(jìn)展)方面是否有差異；生存分析檢驗采用Log-rank法檢驗，并計算其風(fēng)險比(hazard ratio，HR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)；診斷效應(yīng)采用曲線下面積(area under curve，AUC)進(jìn)行評估，并計算最佳截斷值及該值的敏感度和特異度。χ2檢驗、t檢驗與ROC曲線采用SPSS 22軟件；生存分析及生存曲線采用GraphPad prism 7軟件。檢驗水準(zhǔn)設(shè)置為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1目的基因篩選Oncomine數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，浸潤性膀胱癌與正常膀胱組織基因表達(dá)差異前20位的基因分別為：UBE2C、AGRN、SHMT2、TPX2、FANCD2、TOP2A、NUSAP1、ISG15、LSR、CKS2、SALL4、AURKA、CDK1、TUBB、RACGAP1、ETV4、CDC25A、TFAP2C、MLF1IP和HMGB3(圖1)。其中UBE2C差異最顯著的基因，即為本研究的候選目的基因。

圖1Oncomine數(shù)據(jù)庫膀胱癌差異基因整合分析結(jié)果(前20位)

2.2GSE13507樣本特征該基因表達(dá)數(shù)據(jù)集共有256例樣本，其中原發(fā)性膀胱癌165例、復(fù)發(fā)性膀胱癌23例、正常膀胱黏膜組織10例和癌旁組織58例。23例復(fù)發(fā)性膀胱癌信息臨床信息資料缺失，故本研究后續(xù)分析僅提取原發(fā)性膀胱癌165例數(shù)據(jù)。165例膀胱癌的基本特征信息見表1。UBE2C基因在165例膀胱癌組織及68例癌旁或正常膀胱組織中表達(dá)具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.000 1，圖2)。

表1 膀胱癌樣本特征

圖2UBE2C基因在膀胱癌和癌旁組織中的表達(dá)差異(GSE13507)

2.3UBE2C表達(dá)水平與膀胱癌臨床病理特征的相關(guān)性結(jié)果如表2所示，UBE2C基因高表達(dá)組與低表達(dá)組在年齡(P=0.264)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.711)和腫瘤復(fù)發(fā)(P=0.481)方面無統(tǒng)計學(xué)差異。但兩組在性別(P=0.005)、浸潤(P=0.001)、T分期(P=0.001)、N分期(P=0.036)、腫瘤進(jìn)展(P=0.011)方面均具有統(tǒng)計學(xué)差異；與UBE2C基因低表達(dá)組相比，高表達(dá)組患者年齡更大、男性更多、肌層浸潤更多、TN分期更高、腫瘤進(jìn)展更多。

2.4UBE2C表達(dá)水平與膀胱癌診斷及預(yù)后的關(guān)系UBE2C診斷膀胱癌的ROC曲線如圖3所示，AUC為0.804(95%CI：0.744～0.863，P<0.001)，UBE2C基因表達(dá)最佳截斷值為9.43，該截斷值的敏感度為58.2%、特異度為88.2%。生存分析結(jié)果顯示，UBE2C基因高表達(dá)組患者的生存期差于低表達(dá)組(HR=1.82，95%CI：1.13～2.94，Log-rankP=0.011，圖4)。

圖3 UBE2C診斷膀胱癌的ROC曲線

圖4 UBE2C表達(dá)水平與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系

表2UBE2C表達(dá)水平與膀胱癌患者臨床病理特征的差異

特征UBE2C表達(dá)水平低表達(dá)組高表達(dá)組χ2值P值年齡(歲)1.250.264 <602418 ≥605865性別7.7790.005 女822 男7461浸潤12.0820.001 非肌層浸潤6241 肌層浸潤2042T分期18.2520.001 Ta186 T14436 T21417 T3316 T438N分期8.5380.036 N07970 N126 N206 N311遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移0.1370.711 否7979 是34腫瘤復(fù)發(fā)0.4970.481 否4225 是2016腫瘤進(jìn)展6.520.011 否7361 是922

3 討 論

隨著轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，將生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究與臨床結(jié)合得更為精密。前期已有研究者發(fā)現(xiàn)JMJD5、TAGLN、CENPF等基因可能參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展[10-12]，為膀胱癌的發(fā)病機制及標(biāo)志物研究提供了新的思路。

UBE2C是泛素偶聯(lián)酶之一，主要與泛素激活酶和泛素連接酶協(xié)同完成泛素蛋白酶體系促進(jìn)靶蛋白泛素化的功能。由于泛素連接酶異常調(diào)節(jié)作用與腫瘤發(fā)病明顯相關(guān)，以往多數(shù)研究以泛素連接酶為研究重點。近年來有研究顯示，泛素偶聯(lián)酶在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和特殊腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中也起到重要作用[13-16]。UBE2C具有泛素偶聯(lián)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程中關(guān)鍵蛋白的講解及調(diào)控有絲分裂紡錘體檢查點等作用[16]。因此，本研究擬采用膀胱癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，分析UBE2C基因與膀胱癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，并分析UBE2C基因診斷膀胱癌的診斷效能。

本研究結(jié)果顯示，與正常膀胱組織或癌旁組織相比，UBE2C基因在膀胱癌組織中表達(dá)增高；在膀胱癌患者中，與UBE2C基因低表達(dá)組相比，高表高表達(dá)組患者年齡更大、男性更多、肌層浸潤更多、TN分期更高、腫瘤進(jìn)展更多；采用UBE2C基因診斷膀胱癌的診斷效能較高，特異度高達(dá)88.2%；此外，生存分析結(jié)果顯示，UBE2C高表達(dá)組患者預(yù)后更差。因此，本研究結(jié)果表明，UBE2C基因可能在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色。我們推測，UBE2C基因可能是膀胱癌靶向治療的新靶點；結(jié)合UBE2C診斷膀胱癌的高特異度，可將其作為聯(lián)合診斷標(biāo)志物之一，也可作為膀胱癌患者預(yù)后的標(biāo)志物之一。

OKAMOTO等[17]研究顯示，UBE2C基因在大多數(shù)正常組織中幾乎很難檢測到。通過基因表達(dá)譜交互分析(GEPIA，http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)[18]數(shù)據(jù)庫查詢UBE2C基因，結(jié)果顯示在所有人體正常組織中均較少表達(dá)；相反，UBE2C基因在很多癌癥組織中呈高表達(dá)，如白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、腎上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、食管癌、肺癌、肝癌、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、輸尿管癌等。但UBE2C基因在癌組織中表達(dá)上調(diào)的機制尚未闡明[19]。通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫(http://www.cbioportal.org/index.do)查詢UBE2C基因，結(jié)果顯示UBE2C基因最主要的變化是基因擴增，這可能是引起表達(dá)增高的機制之一。也有研究者提出UBE2C基因上游的超活化蛋白表達(dá)增高可引起UBE2C基因高表達(dá)[13]。此外，在乳腺癌細(xì)胞中，抑癌基因C2ORF4O可抑制UBE2C基因表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和侵襲[20]。通過USCS數(shù)據(jù)庫(http://genome.ucsc.edu/index.html)查詢UBE2C基因，發(fā)現(xiàn)UBE2C基因發(fā)生單核苷酸多態(tài)性的位點較多，這些位點的突變是否與UBE2C基因表達(dá)水平有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，UBE2C基因可能參與膀胱癌的發(fā)生與發(fā)展，可能是膀胱癌靶向治療的新靶點、膀胱癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。UBE2C基因如何調(diào)控膀胱癌的發(fā)生發(fā)展尚待進(jìn)一步開展相關(guān)機制研究進(jìn)行闡述。