譚慶輝，丁朝陽(yáng)，王喜紅，趙新宇，熊德友，何世成，王昌建

（1. 湖南省婁底市動(dòng)物疫病預(yù)防控中心，湖南婁底 417000；2. 湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長(zhǎng)沙 410014）

禽流感（Avian Influenza）是由A型流感病毒引起的一種家禽和野禽的，從呼吸系統(tǒng)到全身敗血癥等多種癥狀的綜合征。根據(jù)病毒表面結(jié)構(gòu)蛋白和抗原性不同，可以將A型流感病毒分為多種血清亞型，目前已鑒定出17種HA亞型和10種NA亞型[1]。根據(jù)禽流感病毒致病性和毒力不同，可以將禽流感分為高致病性、低致病性和無(wú)致病性。高致病性禽流感多由H5和H7亞型毒株引起，發(fā)病率和致死率很高，對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)及公共衛(wèi)生具有嚴(yán)重影響。2004年初，H5亞型高致病性禽流感在我國(guó)16個(gè)省份暴發(fā)。2017年3月，H7N9亞型高致病性流感首次在我國(guó)家禽養(yǎng)殖業(yè)中暴發(fā)，隨后全國(guó)多地監(jiān)測(cè)到H7N9亞型高致病性毒株，對(duì)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)極大威脅[2-3]。近年來(lái)，我國(guó)采取“免疫與撲殺相結(jié)合”的綜合防治措施，取得了良好的防控效果[4]。

根據(jù)禽流感病毒變異情況，我國(guó)農(nóng)業(yè)部決定從2017年下半年開(kāi)始，采用重組流感病毒（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株）（以下簡(jiǎn)稱H5+H7二價(jià)滅活疫苗），對(duì)禽類進(jìn)行免疫接種。本試驗(yàn)采用哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)的重組流感病毒（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗，分別對(duì)鵪鶉和肉鴿進(jìn)行注射免疫，跟蹤觀察免疫后的臨床變化，并進(jìn)行抗體水平檢測(cè)，以期了解H5和H7亞型的HI抗體效價(jià)在鵪鶉和肉鴿體內(nèi)的消長(zhǎng)規(guī)律，為科學(xué)推薦鴿子和鵪鶉的免疫程序提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 重組流感病毒（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株）：生產(chǎn)批號(hào)2017045，由哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)。

1.1.2 主要試劑 禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原（批號(hào)2018001，有效期2年），禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原（批號(hào)2017019，有效期2年），禽流感病毒H5亞型陽(yáng)性血清（批號(hào)2017004，有效期2年），禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原（批號(hào)2017005，有效期2年）：均由國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室提供；鵪鶉試驗(yàn)用紅細(xì)胞，采自農(nóng)戶非免疫的雄鵪鶉，鴿子試驗(yàn)用紅細(xì)胞，采自農(nóng)戶非免疫的雄鴿子，均按常規(guī)方法制備成1%懸液；0.1 mol/L PBS（pH7.2）：由實(shí)驗(yàn)室常規(guī)配置，高壓滅菌；禽流感（H5/H7亞型）病毒核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ嘿?gòu)自廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1.1.3 主要儀器耗材 一次性96孔血凝板（V型底）、移液器、微量振蕩器、低速離心機(jī)、ABI 7500-FSAT熒光PCR儀等。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組與疫苗接種 鵪鶉試驗(yàn)于2017年12月—2018年6月在漣源市楊市鎮(zhèn)園藝場(chǎng)毛泉若鵪鶉養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行。隨機(jī)選擇25日齡、體質(zhì)量約100 g的非免疫鵪鶉（品種為日朝雜交蛋用型）500羽裝籠，每籠50羽，共10籠。鴿子試驗(yàn)于2017年12月—2018年6月在婁底市婁星區(qū)杉山鎮(zhèn)李獻(xiàn)民肉鴿養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行。隨機(jī)選擇25日齡、體質(zhì)量約400 g的非免疫肉鴿（品種為美國(guó)王鴿）180對(duì)（共360羽，雌性各半）裝籠，每籠12對(duì)（24羽）。鵪鶉與鴿子試驗(yàn)均分為3組（表1），按照免疫程序（25日齡首免，46日齡二免，鵪鶉和鴿子的劑量分別為0.3 mL和1 mL），采用胸部肌內(nèi)注射方式，并對(duì)各試驗(yàn)組在飼料、飼養(yǎng)環(huán)境等方面提供相同條件。

表1 試驗(yàn)分組及數(shù)量 單位：羽

1.2.2 免疫副反應(yīng)觀察 對(duì)各試驗(yàn)組，分別于免疫后 0、4、8、12、24、36、48、60和 72 h，觀察群體臨床變化并記錄。

1.2.3 樣品采集 血清樣品：分別在免疫前及免疫 后 14、21、28、35、42、49、77、105、133、161和189 d，隨機(jī)采集血樣（每次每組血液樣品不少于30份），分離血清，-20 ℃保存待檢。拭子樣品：分別在免疫前及免疫后49、105、161和189 d，采集咽喉/泄殖腔棉拭子樣品，并與血清樣品一一對(duì)應(yīng)，放入事先加入1 mL PBS液（pH7.2）的離心管中，-70 ℃保存待檢。

1.2.4 檢測(cè) 對(duì)血清樣品，按《高致病性禽流感診斷技術(shù)-血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)》（GB18936—2003）進(jìn)行H5和H7亞型抗體檢測(cè)，樣品效價(jià)大于或等于4log2判為合格。對(duì)咽喉/泄殖腔棉拭子樣品，按照《禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法》（GB/T19438.1—2004）進(jìn)行H5/H7亞型病毒核酸檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

鵪鶉和鴿子免疫（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗后均無(wú)不良組織反應(yīng)產(chǎn)生。鵪鶉試驗(yàn)組在采食、精神狀況和糞便等方面均未出現(xiàn)不良反應(yīng)；鴿子組首次免疫后出現(xiàn)采食量略有下降、精神狀況欠佳等狀況，但24 h后恢復(fù)正常，二次免疫后未見(jiàn)不良反應(yīng)。

2.2 病原檢測(cè)

采集的所有咽喉/泄殖腔棉拭子樣品中，均未檢出H5、H7亞型病毒核酸陽(yáng)性。

2.3 抗體檢測(cè)

圖1 （H5+H7）二價(jià)滅活疫苗免疫鵪鶉后誘導(dǎo)的抗體及其持續(xù)期

2.3.1 鵪鶉抗體消長(zhǎng) （H5+H7）二價(jià)滅活疫苗免疫鵪鶉后，可較好地刺激機(jī)體產(chǎn)生H5和H7亞型抗體，并且兩種抗體消長(zhǎng)規(guī)律基本一致（圖1）。首次免疫后，兩種抗體均迅速上升。A組在免疫后21 d，H5亞型抗體達(dá)到高峰，平均效價(jià)為（7.7±1.3）log2，之后抗體效價(jià)逐漸下降，到免疫后49 d，下降到（4.1±1.6）log2，抗體合格率為73.3%；B組在第21天加強(qiáng)免疫后，H5抗體效價(jià)明顯提升，加強(qiáng)免疫后14 d（首免后35 d）達(dá)到高峰，效價(jià)為（9.7±0.9）log2，到第161 天，抗體效價(jià)仍為4log2，此時(shí)的抗體合格率為76.7%。C組對(duì)照組全程沒(méi)有檢測(cè)到抗體。A組首免后21 d，H7亞型抗體效價(jià)達(dá)到高峰，平均效價(jià)為（8.5±1.3）log2。隨后逐漸下降，免疫后77 d，抗體下降到（4±1.4）log2，抗體合格率為63.3%；B組加強(qiáng)免疫后7 d（首免后28 d），H7抗體效價(jià)達(dá)到高峰，效價(jià)達(dá)到（10.3±0.9）log2，隨后雖然逐漸下降，但到首免后第189 天，抗體效價(jià)仍為4.3log2，陽(yáng)性率為70.0%。

2.3.2 鴿子抗體消長(zhǎng) D組鴿子首免后21 d，H5和H7亞型抗體效價(jià)均到達(dá)高峰，效價(jià)分別為（9.8±0.8）log2、（10.4±1.1）log2。隨 后抗體效價(jià)緩慢衰減，到第189天檢測(cè)，兩種亞型的抗體效價(jià)都保持在4log2以上。E組加強(qiáng)免疫后7 d（首免后28 d），H5和H7抗體效價(jià)均出現(xiàn)高峰，效價(jià)分別為（10.2±1.0）log2、（10.7±0.9）log2，到首免后第189天，效價(jià)仍分別保持在（5.4±1.3）log2、（6.1±1.5）log2（圖2），合格率分別為96.7%、100%（圖3）。

圖2 （H5+H7）二價(jià)滅活疫苗免疫鴿子后誘導(dǎo)的抗體及其持續(xù)期

圖3 免疫后鵪鶉和鴿子H5和H7亞型抗體合格率變化

3 分析與討論

動(dòng)物機(jī)體受外界抗原刺激后產(chǎn)生的特異性抗體具有重要的抗感染作用，其消長(zhǎng)規(guī)律反映了動(dòng)物機(jī)體的抗感染能力，因此檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)的抗體消長(zhǎng)規(guī)律，對(duì)于疫病防治十分重要。

3.1 H5和H7亞型抗體水平比較

從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗免疫鵪鶉和鴿子后，兩種亞型的抗體消長(zhǎng)規(guī)律基本一致，但是同一時(shí)間點(diǎn)的H7亞型抗體效價(jià)要比H5亞型高，差異極顯著（P＜0.01），說(shuō)明（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗中的H7亞型更能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，但也可能是疫苗生產(chǎn)中的配比不同導(dǎo)致的。

3.2 鵪鶉和鴿子免疫效果比較

本次試驗(yàn)結(jié)果表明，同種禽流感疫苗免疫，與鵪鶉相比，鴿子產(chǎn)生H5和H7亞型抗體的時(shí)間更短，產(chǎn)生的效價(jià)更高。一次免疫后，鵪鶉的H5和H7亞型平均抗體效價(jià)最高峰分別為（7.7±1.3）log2、（8.5±1.6）log2，而鴿子分別高達(dá)（9.8±0.80）log2、（10.3±1.1）log2。在抗體維持免疫合格的時(shí)間上（HI抗體4log2以上為合格），鴿子比鵪鶉要長(zhǎng)。在加強(qiáng)免疫方面，鴿子產(chǎn)生的HI抗體滴度和維持免疫合格的時(shí)間都比鵪鶉高或長(zhǎng)，差異極顯著（P＜0.01），說(shuō)明這種重組禽流感病毒滅活疫苗對(duì)鴿子的免疫效果要比鵪鶉好，這可能與不同類型的禽類在免疫機(jī)能上存在差異有關(guān)[5-6]。

3.3 鵪鶉一次免疫與二次免疫效果比較

不同分支、不同亞型AIV對(duì)鵪鶉的致病性也不一樣[7]。免疫良好種鵪鶉的子代可獲得高滴度的抗體效價(jià)，其母源抗體可持續(xù)到20日齡左右[8]。鵪鶉二次免疫后產(chǎn)生的免疫效果比一次免疫的要好，兩種免疫程序在抗體水平上升幅度和抗體合格水平維持時(shí)間方面存在明顯差異（P＜0.01）。鵪鶉試驗(yàn)結(jié)果表明，在25日齡一次免疫接種0.3 mL（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗，誘導(dǎo)的保護(hù)性HI抗體（4log2以上）僅能持續(xù)7周左右，在46日齡加強(qiáng)免疫0.3 mL后，其保護(hù)性抗體水平可維持到23周左右?？紤]到鵪鶉開(kāi)產(chǎn)日齡在35日齡左右，產(chǎn)蛋期一般為8～10個(gè)月，因此在生產(chǎn)中推薦25日齡首免，每羽0.3 mL，46日齡同等劑量加強(qiáng)免疫1次，6月齡再加強(qiáng)免疫1次。

3.4 鴿子一次免疫與二次免疫效果比較

鴿子一免組與二免組免疫效果呈明顯正相關(guān)，兩組之間差異顯著（P＜0.05）。25日齡一次免疫接種1 mL（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗，27周后抗體效價(jià)仍保持在4log2以上，合格率在80%以上，超過(guò)了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的70%的群體保護(hù)水平。因此，根據(jù)肉鴿生產(chǎn)周期，建議在25日齡免疫接種，每羽1 mL，以后每隔6個(gè)月免疫1次，每次1 mL。

考慮到肌內(nèi)注射的普遍性，本試驗(yàn)并沒(méi)有進(jìn)行皮下注射試驗(yàn)。鴿子是自然孵育雛鴿，胸部肌內(nèi)注射疫苗對(duì)鴿子孵化有一定影響。在免疫后的臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，鴿子有輕微的免疫不良反應(yīng)，這可能是因?yàn)轼澴颖旧韺?duì)禽流感疫苗反應(yīng)強(qiáng)烈，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答較強(qiáng)。另外，免疫劑量過(guò)高也可能是引起免疫不良反應(yīng)的原因之一，需后續(xù)探討免疫劑量與免疫效果的關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究表明，（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗對(duì)鵪鶉和鴿子能產(chǎn)生良好的抗體反應(yīng)，具有較好的免疫保護(hù)效果，同時(shí)無(wú)免疫不良反應(yīng)，疫苗安全有效。生產(chǎn)中推薦：鵪鶉25日齡首免，46日齡和6月齡各加強(qiáng)免疫1次，劑量為0.3 mL；鴿子25日齡首免，以后每隔6個(gè)月加強(qiáng)免疫1次，劑量為1 mL。