劉愛玲，馬清霞，韓 雪，沈朝建，康京麗，張 毅，王幼明

（1. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 青島市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東青島 266071；3. 北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，北京 100107）

牛結(jié)核?。˙ovine tuberculosis，TB）是由牛結(jié)核分枝桿菌引起的一種人獸共患慢性傳染病，可侵害多種動(dòng)物，家畜中奶牛最易感染[1]。牛結(jié)核病，尤其是奶牛結(jié)核病，不但影響奶牛生產(chǎn)力，而且威脅人的身體健康，因此加強(qiáng)結(jié)核病防控具有重要的公共衛(wèi)生意義。

牛結(jié)核病潛伏期長(zhǎng)短不一，自然感染的病例潛伏期為16～45 d，甚至在幾個(gè)月以上或數(shù)年。關(guān)于結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)因素，有研究表明野生動(dòng)物是牛結(jié)核病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素，其種類因地區(qū)不同而異，如在非洲是水牛，在歐洲是野豬和獾，在新西蘭是負(fù)鼠[2-3]。鹿也是牛結(jié)核病的潛在感染源[4]。家養(yǎng)動(dòng)物主要通過野生動(dòng)物感染[5]。野生動(dòng)物這一風(fēng)險(xiǎn)因素的存在，是牛結(jié)核病難易根除的一個(gè)主要原因，宿主的廣泛性和疾病控制的限制性使得牛結(jié)核病作為人獸共患病，備受公共衛(wèi)生方面的關(guān)注[6]。Morris等[4]研究表明，雖然牛結(jié)核分枝桿菌宿主廣泛，但近些年主要感染牛和人。牛結(jié)核病可以通過空氣傳播[7]，而不易通過污染的飼料和牧草傳播。因?yàn)樵诂F(xiàn)實(shí)條件下，污染物中的細(xì)菌存活時(shí)間相對(duì)短，動(dòng)物通過消化道途徑不易暴露至感染劑量，但可以通過口咽部黏膜感染[4]。有研究將牛結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)因素分為國(guó)家、群體和動(dòng)物水平：在群體水平方面，風(fēng)險(xiǎn)因素包括人和動(dòng)物的牛結(jié)核病史、群體大小、牛場(chǎng)類型以及管理方面因素（養(yǎng)殖密度、糞便、飼料、糞-口傳播途徑等），還包括診斷試驗(yàn)效果、皮試檢測(cè)頻率、人工和獸醫(yī)服務(wù)質(zhì)量、撲殺率、其他家養(yǎng)動(dòng)物、野生動(dòng)物、存在分枝桿菌的環(huán)境、天氣變化，以及牛的引進(jìn)、調(diào)運(yùn)等[8]。

萊西市是山東省主要奶牛生產(chǎn)基地，擁有以“雀巢”“迎春樂”“新希望”為龍頭的奶業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈[9]。本研究以萊西市所有奶牛為目標(biāo)群，采用橫斷面研究方法，通過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)估計(jì)萊西市奶牛結(jié)核病的群流行率和個(gè)體流行率，采用病例對(duì)照研究方法，分析奶牛結(jié)核病傳播的可能風(fēng)險(xiǎn)因素，并建立回歸模型，以期為奶牛結(jié)核病防控策略改進(jìn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 目標(biāo)群及抽樣策略

2016年萊西市共有548個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)（戶），存欄34 962頭奶牛。本研究以萊西市所有奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）為目標(biāo)群，按照養(yǎng)殖規(guī)模不同，采取不同的抽樣策略。存欄量30頭以上的場(chǎng)（戶）259個(gè)，全部檢測(cè)，場(chǎng)（戶）內(nèi)隨機(jī)抽樣30頭檢測(cè)；存欄量30頭以下的場(chǎng)（戶）289個(gè)，采用隨機(jī)抽樣的方法，按照置信區(qū)間95.0%、預(yù)期流行率15.0%、可接受誤差5.0%，計(jì)算出的抽樣場(chǎng)（戶）數(shù)為117個(gè)，場(chǎng)（戶）內(nèi)奶牛全部檢測(cè)。

2.2 樣本收集和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

按照抽樣策略，采集3月齡以上、未懷孕的奶牛血液樣本，分離血清，按照牛型結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)試劑盒（IDEXXM.bovis）說明進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)ELISA抗體檢測(cè)陽(yáng)性場(chǎng)（戶）內(nèi)所有奶牛，采用ELISA方法和單純皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（SICT）垂直試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)[10-12]。

2.3 病例定義

采用垂直試驗(yàn)方法，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的動(dòng)物為陽(yáng)性個(gè)體。

采用ELISA方法，至少檢出3個(gè)陽(yáng)性樣本的奶牛場(chǎng)或養(yǎng)殖戶為陽(yáng)性群。

所有陽(yáng)性群均為病例，在病例所在同一自然村內(nèi)，選擇相同養(yǎng)殖規(guī)模的陰性群為對(duì)照。對(duì)照數(shù)是病例數(shù)的4倍。

2.4 數(shù)據(jù)來源與分析

結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，以場(chǎng)群為單位，采用病例對(duì)照研究方法，進(jìn)行問卷調(diào)查，獲取奶牛衛(wèi)生狀況及風(fēng)險(xiǎn)因素相關(guān)數(shù)據(jù)。

使用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入、整理及部分圖表繪制；使用Epi InfoTM7軟件進(jìn)行四格表和Logistic 回歸分析，并建立回歸模型；用IBM SPSS statistics 22對(duì)模型預(yù)測(cè)概率進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.5 敏感性和特異性計(jì)算

根據(jù)采用IDEXX 試劑盒檢測(cè)牛結(jié)核病的有關(guān)研究[13]，設(shè)定ELISA試驗(yàn)檢測(cè)敏感性Se1=63.0%，特異性Sp1=98.0%。根據(jù)群敏感性公式 HSe=1-(1-p)n= 1-{1-[p×Se+(1-p)(1-Sp)]}n和群特異性公式HSp=Spn，獲得檢測(cè)群敏感性和群特異性。式中，p是場(chǎng)內(nèi)預(yù)估流行率（15.0%），n為場(chǎng)內(nèi)抽樣數(shù)量。

根據(jù)結(jié)核病檢測(cè)方法有關(guān)研究[11]，設(shè)定SICT試驗(yàn)敏感性Se2=80.0%，特異性Sp2=96.0%，根據(jù)公式Se3=Se1×Se2，Sp3=1-(1-Sp1)(1-Sp2)，計(jì)算垂直試驗(yàn)敏感性 Se3=50.4%，特異性Sp3=99.9%。

2.6 流行率計(jì)算

表觀流行率（AP）=檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)量/檢測(cè)總數(shù)；

真實(shí)流行率（TP）=(AP+Sp-1) / (Se+Sp-1)；

95%置信區(qū)間：95%CI=p±式中，p為真實(shí)流行率，Z為標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布中概率為0.05所對(duì)應(yīng)的值，n為抽樣數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 流行率估計(jì)

2.1.1 群流行率 根據(jù)群敏感性和特異性公式，按照?qǐng)鰞?nèi)抽樣30、場(chǎng)內(nèi)預(yù)估流行率15.0%，將至少檢測(cè)到3個(gè)陽(yáng)性動(dòng)物的群定義為陽(yáng)性群，群敏感性（HSe）=66.5%，群特異性（HSp）=97.8%（表1）。本次共調(diào)查了548個(gè)場(chǎng)，檢測(cè)了其中376個(gè)，用ELISA方法共檢測(cè)到26個(gè)陽(yáng)性場(chǎng)；檢測(cè)了存欄量在30頭以上的場(chǎng)（戶）259個(gè)，檢出陽(yáng)性場(chǎng)（戶）16個(gè)，檢測(cè)30頭以下場(chǎng)（戶）117個(gè)，檢出陽(yáng)性場(chǎng)（戶）10個(gè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算群表觀流行率（AP）=6.9%，根據(jù)公式TP =(AP+HSp-1)/(HSe+HSp-1)，得到真實(shí)流行率（TP）=7.3%（95%CI：4.7%～10.0%），存欄30頭以下場(chǎng)（戶）的群流行率高于存欄30以上場(chǎng)（戶），詳見表2。

表1 不同陽(yáng)性數(shù)的群敏感性和特異性計(jì)算 單位：%

表2 奶牛結(jié)核病群流行率測(cè)量結(jié)果

2.1.2 個(gè)體流行率 本次調(diào)查共檢測(cè)樣品8 880份，檢出陽(yáng)性93份，其中檢測(cè)存欄量30頭以上場(chǎng)（戶）樣品7 770份，檢出陽(yáng)性81份，檢測(cè)存欄30頭以下場(chǎng)（戶）樣品1 110份，檢出陽(yáng)性12份。根據(jù)公式計(jì)算得到，萊西市奶牛結(jié)核病個(gè)體表觀流行率（AP）=1.0%，真實(shí)流行率（TP）=1.9%（95%CI：1.6%～2.2%）。存欄30頭以下和30頭以上場(chǎng)（戶）間個(gè)體流行率無顯著差異（P＞0.05），詳見表3。

表3 奶牛結(jié)核病個(gè)體流行率測(cè)量結(jié)果

3.2 風(fēng)險(xiǎn)因素分析

3.2.1 單因素分析 本研究采用病例對(duì)照方法，對(duì)220個(gè)場(chǎng)（戶）進(jìn)行了問卷調(diào)查，共涉及11個(gè)場(chǎng)（戶）間奶牛結(jié)核病傳播相關(guān)影響因素。單因素分析結(jié)果（表4）顯示，“養(yǎng)殖環(huán)境、是否隔離、產(chǎn)犢場(chǎng)地、接生人員、擠奶方式、糞便處理方式和診治人員”7個(gè)變量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.1）。經(jīng)Mantel-Haenszel分層分析發(fā)現(xiàn)，在“擠奶方式”分層條件下，“是否隔離”變量未調(diào)整前，OR=4.37（95%CI：1.95～9.80，P＜0.001），調(diào)整后，OR=5.18（95%CI：1.80～14.9，P＜0.001），表明“擠奶方式”對(duì)“是否隔離”有一定影響，是可能的混雜因素。

3.2.2 Logistic回歸分析 通過Logistic回歸，對(duì)以上7個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素進(jìn)行分析，多因素分析發(fā)現(xiàn)，“養(yǎng)殖環(huán)境、是否隔離、產(chǎn)犢場(chǎng)地、接生人員”等因素具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過似然比檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，“是否隔離和擠奶方式”存在交互作用（LD=243.6427-234.9130=8.73，DF=1，P=0.007）。 將混雜因素和交互作用因素放入模型，Logistic回歸模型為Y= -3.984+1.268X1+4.284X2+1.105X3+1.581X4+0.612X5-3.810X2X5，相關(guān)參數(shù)見表5。經(jīng)Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)，P=0.05，似然比檢驗(yàn)-2lnL=196.394，模型擬合度較好。用SPSS軟件繪制ROC曲線檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蜏?zhǔn)確性，ROC曲線下面 積 為 0.808（95%CI：0.736～0.880，SE=0.037，P＜0.001），表明該模型預(yù)測(cè)概率較好（圖1）。

表4 影響因素的單因素分析

圖1 回歸模型的ROC曲線

表5 Logistic回歸分析結(jié)果

4 討論

萊西市是奶牛養(yǎng)殖示范地區(qū)，養(yǎng)殖模式分為規(guī)模場(chǎng)、養(yǎng)殖小區(qū)和奶牛集中村3種，規(guī)模化程度較高，生物安全措施較好。往年監(jiān)測(cè)的奶牛結(jié)核病場(chǎng)群流行率和個(gè)體流行率均較低。本研究對(duì)萊西市69%的奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）進(jìn)行了不同方式的抽樣檢測(cè)，對(duì)于養(yǎng)殖量30頭奶牛以上的場(chǎng)（戶）全檢，場(chǎng)內(nèi)隨機(jī)抽樣30頭，30頭以下場(chǎng)（戶）的場(chǎng)內(nèi)牛全檢。雖然對(duì)于養(yǎng)殖量大的場(chǎng)（戶）抽樣量不足，但因檢測(cè)覆蓋面較廣，檢測(cè)結(jié)果仍具有代表性，可在一定程度上反映該地區(qū)奶牛結(jié)核病的真實(shí)流行情況。

雖然目前SICT仍是牛結(jié)核病現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的國(guó)際通用方法，但由于敏感性較低，其并不是最佳方法[13]。IFN-γ檢測(cè)方法也被廣泛應(yīng)于牛結(jié)核病檢測(cè)，但是試驗(yàn)的特異性和敏感性不是最好。診斷試驗(yàn)方法的缺乏也是導(dǎo)致牛結(jié)核病重復(fù)出現(xiàn)的一個(gè)重要原因[14]。本研究采用ELISA方法進(jìn)行場(chǎng)群流行率估算。由于ELISA試驗(yàn)敏感性較低，僅為63.0%，如果以發(fā)現(xiàn)1個(gè)陽(yáng)性病例為依據(jù)定義陽(yáng)性場(chǎng)，則陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0，不能發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性病例，因此本研究以發(fā)現(xiàn)3個(gè)陽(yáng)性病例為依據(jù)定義陽(yáng)性場(chǎng)群，計(jì)算檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為70.5%，陰性預(yù)測(cè)值為97.4%，試驗(yàn)敏感性為66.5%，特異性為97.8%，可以估算本地區(qū)奶牛結(jié)核群真實(shí)流行率。對(duì)于個(gè)體流行率估算，本研究采用ELISA和SCIT垂直試驗(yàn)的方法，試驗(yàn)特異性可達(dá)99.9%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為99.4%，假陽(yáng)性非常少。但由于試驗(yàn)敏感性僅為50.4%，個(gè)體表觀流行率和真實(shí)流行率分別為1.0% 和1.9%，兩者差別較大[15]。

萊西市的養(yǎng)殖類型既有封閉式，也有開放式。而封閉式管理多為規(guī)模場(chǎng)和奶牛小區(qū)，開放式多為奶牛集中村。因養(yǎng)殖類型與養(yǎng)殖環(huán)境具有相似性，故本研究?jī)H將養(yǎng)殖環(huán)境列入影響因素進(jìn)行分析?？紤]到本地區(qū)特殊的養(yǎng)殖環(huán)境，如果同一養(yǎng)殖小區(qū)或集中村包含多個(gè)養(yǎng)殖戶，在進(jìn)行流行率計(jì)算時(shí)將其定義為一個(gè)病例，但在進(jìn)行病例對(duì)照研究時(shí)，如果同一養(yǎng)殖小區(qū)或集中村出現(xiàn)多個(gè)病例，則視為多個(gè)病例。

本研究共對(duì)220個(gè)場(chǎng)（戶）進(jìn)行了問卷調(diào)查，其中病例63個(gè)、對(duì)照157個(gè)。病例和對(duì)照組由于養(yǎng)殖類型的關(guān)系，存在很多相同的養(yǎng)殖方式和管理措施，對(duì)影響因素分析結(jié)果可能存在一定的偏倚。對(duì)于奶牛結(jié)核病相關(guān)影響因素的選擇，胎兒及流產(chǎn)物的處理方式本應(yīng)列入影響因素，但通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)對(duì)此均采取焚燒或掩埋的方式處理，故不作為該地區(qū)奶牛結(jié)核病傳播影響因素。

對(duì)所選擇的11個(gè)影響因素進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，“是否隔離”與“擠奶方式”之間存在交互作用，且“擠奶方式”可能影響隔離措施。雖然這兩個(gè)因素在生物學(xué)上看似無關(guān)聯(lián)，但考慮到這兩個(gè)因素可能均與經(jīng)濟(jì)相關(guān)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故本研究將交互和混雜因素均列入模型中。對(duì)于是否將交互作用加入模型中，通過建立不同模型進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)加入交互作用后，似然比檢驗(yàn)差異極顯 著（LR=204.7843-196.3945=8.38，DF=1，P＜0.005）。將加入交互作用的模型進(jìn)行擬合度檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)P=0.05，表明該模型可以接受。

5 結(jié)論

采用ELISA血清學(xué)檢測(cè)，估計(jì)萊西市奶牛結(jié)核病的群真實(shí)流行率為7.3%（95%CI：4.7%～10.0%）；ELISA和SICT垂直試驗(yàn)檢測(cè)，估計(jì)萊西市奶牛結(jié)核病個(gè)體真實(shí)流行率為1.9%（95%CI：1.6%～2.2%）。病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，“規(guī)模場(chǎng)、無隔離措施、無產(chǎn)犢場(chǎng)地、外來人員接生”等為萊西市奶牛結(jié)核病傳播相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素。本研究可為本地區(qū)奶牛結(jié)核病防控提供依據(jù)。