曾依翎 相雪蓮 許丹寧 曹 楠

（1.仲愷農業(yè)工程學院動物科技學院，廣東 廣州 510225；2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 廣州 510225）

Gag基因編碼病毒內部非糖基化結構的蛋白，包括衣殼（Capsid，CA，p27）、基質蛋白（Matrix，MA，p19）、p10、核衣殼（Nucleocapsid，NC，p12）和蛋白酶（Protease，PR，p15）。此類蛋白在各亞群中具有高度保守性，其中國內外許多檢測ALV的ELISA方法便是基于p27基因的高度保守性［11］。p27基因表達ALV的衣殼蛋白上有多個具有活性的抗原位點，研究發(fā)現(xiàn)p27蛋白可與細胞中的GRP78蛋白結合，在病毒進入細胞、抗原呈遞、細胞信號傳導等方面發(fā)揮重要作用，與感染ALV的雞群產生免疫抑制有重要關聯(lián)，然而兩者之間的作用機理還有待研究［12］。

Pol基因編碼病毒的整合酶（Integrase，IN，p32）與反轉錄酶（Reverse Transcriptase，RT）。ALV致密的核心內含有反轉錄酶和整合酶，其中反轉錄酶將病毒RNA反轉錄為前病毒DNA，整合酶再將病毒DNA整合進宿主染色體，因此pol基因對于病毒的復制有重要作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，pol基因的突變導致ALV-K毒株的逆轉錄酶活性、復制能力和垂直傳播能力都有了明顯的增強，并且這種突變具有穩(wěn)定的遺傳性，揭示著pol基因在ALV的傳播上的重要作用。

Env基因編碼病毒的囊膜糖基化蛋白，其中gp85基因編碼的膜表面糖蛋白亞單位（Surface Glycoproteinunit，SU）和gp37基因編碼的跨膜糖蛋白亞單位（Transmenbrance Protein，TM）二者連接組合形成桿狀的二聚體，附著于囊膜表面，即病毒糖蛋白。SU決定宿主范圍和亞群特異性［13］，序列中心區(qū)域含有高變區(qū)（Hypervariable Region）hr1、hr2和可變區(qū)（Variable Region）vr1、vr2、vr3［14］，

禽白血病病毒（Avian Leukosis Vius，ALV）可以引起禽類多種具有傳染性的良性和惡性腫瘤性疾病，具有感染率高但發(fā)病率低的特點［1］。感染禽白血病病毒的臨床表現(xiàn)包括血管瘤、髓細胞樣白血病、成髓細胞白血病、成紅細胞性白血病、結締組織性腫瘤、骨硬化病及淋巴細胞性白血病等［2-3］。ALV對養(yǎng)禽業(yè)造成的危害是多方面的：一是直接發(fā)病，病雞產生腫瘤，最終死亡；二是免疫抑制，發(fā)病雞繼發(fā)多種疾病，對疫苗免疫應答差，生產性能受到嚴重影響［4-5］；三是危害子代雞，祖代或父母代雞一旦發(fā)病，將嚴重影響雛雞的質量［6］。ALV可以通過母雞的生殖系統(tǒng)傳染給子代，使雛雞在出生時便帶毒，排出的胎糞又能水平傳播，傳染整個雛雞群，因此日齡越小的雞群越容易通過水平傳播感染。更有報道從雞場工作人員體內檢測出了ALV抗體，說明ALV對公共衛(wèi)生存在潛在威脅［7］。

1 禽白血病病毒基因組研究進展

ALV屬于禽α反轉錄病毒屬，根據病毒的囊膜蛋白特性等將ALV分為A～J 10個亞群［8］，以及新發(fā)現(xiàn)的K亞群［9］。其中，從雞分離到的有7個亞群［10］，分別為A、B、C、D、E、J、K亞群。

ALV對熱不穩(wěn)定，對脂溶性溶劑敏感，對紫外線有一定抗性。電鏡下病毒顆粒為球形，直徑80～145 nm，表面有約8 nm纖突，外層由囊膜包裹，囊膜表面有穿膜蛋白和表面蛋白，決定病毒的宿主范圍，致密的核心呈二十面體，含二倍體RNA、反轉錄酶、整合酶等復制所需組分。

ALV基因組全長7.6～7.8 kb，為典型的慢轉化型反轉錄病毒序列結構，全基因組序列為5’-R-U5-gag-pol-決定了病毒的特異性和中和活性，兩端較為保守。由gp37編碼的TM在N端與C端各含有一個疏水區(qū)，介導病毒與細胞膜的融合過程。研究發(fā)現(xiàn)，gp37的部分序列差異將Env分為3種，分別為抑制型Env、活躍型Env和雙功能型Env［15］。

ALV上的SU與宿主細胞上的受體相結合，引發(fā)TM的構象變化從而介導病毒囊膜與細胞膜融合，在細胞質內釋放核心；核心內的反轉錄酶以病毒RNA為模板合成前病毒DNA，此時形成RNA:DNA雜交鏈；RNA酶H降解病毒RNA，以病毒DNA為模板合成新的病毒DNA，此時形成DNA雙鏈；線型的雙鏈DNA進入細胞核，在整合酶的作用下插入宿主的染色體中；病毒DNA兩端的長末端重復序列（Long Terminal Repeat，LTR）具有轉錄增強子和啟動子的作用［16］，利用細胞內的物質合成組裝新病毒，最終釋放至細胞外，繼續(xù)感染其他宿主細胞。

2 禽白血病檢測和診斷研究進展

2.1 臨床診斷

臨床上ALV的感染會引起雞群生長緩慢、生產性能下降，繼發(fā)感染馬立克氏病，部分發(fā)病雞產生腫瘤最終死亡，這些癥狀一般在雞感染禽白血病后一段時間才會發(fā)生。解剖病雞部分可見血管瘤、脾臟腫大、胸骨肋骨腫瘤結節(jié)、胸腺萎縮和淋巴瘤等典型癥狀。然而，更多臨床案例表明，禽白血病常與馬立克氏病、傳染性法氏囊病等雞的免疫抑制病混合感染［12］，雞群感染率高，發(fā)病較低，感染雞能在雞群中擴散病毒，使雞群整體帶毒，最終降低生產性能，給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經濟損失。臨床診斷法不能及時檢測出雞群中的帶毒雞，只有當雞群發(fā)病時才能進行診斷，而且由于混合感染，僅靠臨床手段難以確診，因此必須結合病毒分離、酶聯(lián)免疫等分子診斷方法，才能確診禽白血病。

2.2 病毒分離

ALV的分離一般采用DF-1細胞或CEF細胞，研究表明DF-1細胞在分離率與準確率上均優(yōu)于CEF細胞［17］。無菌采集含ALV的病料，包括血清、血漿、泄殖腔棉拭子、蛋清、精液、腫瘤病灶、肝和脾等，研磨后經0.22 μm的濾器過濾，接種至長滿單層的DF-1細胞，培養(yǎng)7～9 d后即可通過免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附試驗或者熒光定量等方法檢測培養(yǎng)液中的病毒含量，確定病料中是否含有ALV。病毒分離法檢測ALV是最為可靠的診斷方法，但該方法需要實驗室條件，對操作人員要求較高，且花費時間較長，不適合大量樣品的檢測。

2.3 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）被廣泛應用于診斷領域，具有特異性強、靈敏性高、較為快速等特點。早期人們根據ALV的測序比對結果，選取亞群間相對保守又有所差異的片段設計引物，通過擴增病毒樣品的前病毒DNA或者RNA，能快速對ALV進行鑒定與分型［17］，結合臨床癥狀與組織病理學診斷，可以對病雞做出初步診斷。

2.4 實時熒光定量PCR

由于PCR檢測ALV的診斷方法在靈敏性、時效性等方面存在不足，研究人員對PCR診斷方法進行改良，建立了ALV-J熒光定量PCR法（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reatcion，qPCR）［18-19］。該方法以ALV-J上高同源性的序列作為TaqMan探針，特異性序列為引物，特異性擴增病毒片段。TaqMan探針上帶有淬滅基團跟熒光基團，僅在結合特定序列時發(fā)出熒光，因此該方法特異性高，還能進行定量分析。研究利用陽性模板建立標準曲線，不僅可以鑒定樣品的ALV-J陽性率，還可以確定樣品中病毒的拷貝數。結果證明該檢測方法具有良好的特異性，與SYBR Green I相比假陽性率更低。比起常規(guī)PCR法檢測ALV-J，該qPCR法可以檢測出最低3.2×102拷貝/μL的ALV-J，靈敏性有巨大的提高［18］。采用qPCR法能更靈敏、快速地檢測出ALV-J，且耗費樣品少、特異性極高，可以排除禽流感病毒、ALV-A、ALV-B、馬立克氏病病毒等病毒的干擾，適用于檢測血清、糞便、脾、肺、氣管等組織。相比于傳統(tǒng)血清學方法檢測ALV，qPCR法耗時更短、準確率更高、重復性好，為快速檢測和準確定量提供良好的支持。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）是針對ALV抗原與抗體的結合特點進行設計的，可以大批量檢測樣品中ALV的抗原或抗體水平，且操作簡潔、快速，重復性良好，適合推廣應用于雞場凈化工作［20］。適用的病料包括蛋清、細胞液、公雞精液、泄殖腔棉拭子等［21］，通常采用各亞群相似性良好的p27蛋白或特異性高的gp85蛋白制備抗體包被酶標板，檢測樣品中的抗原水平，反應值高于閾值時判斷樣品為ALV陽性。然而，該方法檢測出的陽性樣品包含內源性ALV的樣品，內源性ALV不引起雞的發(fā)病，屬于假陽性，因此凈化工作會對雞場造成一定損失。而且gp85基因含有高變異區(qū)，各分離株相似性低，采用單一毒株的gp85基因制備的抗體易存在覆蓋率低的問題［22］。在國外，檢測ALV-J的特異性膜蛋白gp85的ELISA試劑盒已商品化，但其價格昂貴，且包被的gp85蛋白與我國各地區(qū)的ALV-J毒株的gp85蛋白具有較大差異，準確率不足，因此難以得到推廣。國內也先后建立了多個ALV-J gp85蛋白檢測方法［23］，然而毒株覆蓋率較低、成本較高的問題仍未得到解決，不適宜推廣。

2.6 間接免疫熒光試驗

間接免疫熒光試驗（Indirect Immunofluorescence As-say，IFA）是將帶熒光標記的特異性單克隆抗體與抗原反應，可以用來確定ALV的亞群，屬于血清學診斷的范疇。1979年，Payne等建立了禽白血病gs抗原的熒光抗體檢測方法［24］，而后Qin等也研制出針對ALV-J的單克隆抗體［25］，可以特異性地檢測ALV-J。該檢測方法由于技術要求較高，對成本與操作人員要求較高，不適合雞場進行大批量樣品檢測，因此屬于實驗室診斷的范疇。

2.7 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediated IsothermalAmplification，LAMP）是一種新興的分子生物學檢測方法，針對ALV多個區(qū)域設計特異性引物，采用一種鏈置換DNA聚合酶，在等溫條件下靜置1～2 h即可完成擴增反應。不同于PCR技術，LAMP不需要經過長時間的擴增反應與電泳操作，具有靈敏性高、特異性強、操作簡單、不需要特殊儀器等優(yōu)點，已被廣泛應用于細菌、寄生蟲和一些流行病毒的臨床診斷中［26］。然而，2015年Hao Peng等研究發(fā)現(xiàn)，LAMP檢測ALV的陽性率比病毒分離法和PCR法檢測出的陽性率更高，具有一定的假陽性［27］?；谠诓僮髋c生產成本上的優(yōu)勢，今后LAMP法檢測ALV在雞場具有很大的應用潛力。

2.8 病毒中和試驗

病毒中和試驗（Virus Neutralization Test，NT）是通過ALV與其相應的抗體發(fā)生中和反應，準確檢測出ALV的亞型，是血清學檢測的范疇［28］。該方法的優(yōu)點是可以大批量檢測樣品，且靈敏性高、特異性好，是檢測ALV的經典方法。然而，該檢測方法需要消耗大量樣品，且耗時長、操作煩瑣，操作難以實現(xiàn)規(guī)范化，臨床上應用較少。

2.9 膠體金試紙條檢測

膠體金試紙條是生產上常用的快速檢測方法之一。該方法以膠體金為免疫標記物，將特異的抗體固定于酸類纖維素膜的一個區(qū)域，浸入的樣品沿著膜移動至區(qū)域時，與抗體發(fā)生特異性結合，產生肉眼可見的條帶，擁有快速、簡便、靈敏等特點，在多種病原菌與流行病毒甚至寄生蟲病的檢測中已得到廣泛的應用。研究人員為了探討膠體金法在ALV檢測中的優(yōu)勢，將國內研發(fā)的2款ALV抗原膠體金檢測試紙條與3款商品化的ALV-p27抗原ELISA檢測試劑盒進行比較，結果表明，膠體金法雖然不與MDV、AIV等禽類病毒產生交叉反應，但在靈敏度上不如ELISA檢測試劑盒，僅能檢測出80 TCID50/mL的ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K和6.25 ng/mL的p27抗原，樣品病毒含量較低時易判斷為陰性，造成漏檢［29-31］，影響凈化工作。膠體金試紙條由于操作簡便、生產成本較低，適合雞場大規(guī)模的檢測，如果能進一步提高膠體金的靈敏性，將有助于該檢測方法的推廣。

3 結語

雖然關于ALV結構、流行病學特征、致病機理等研究越來越多，但是依然有很多問題亟待解決，如ALV基因的遺傳變異規(guī)律、快速靈敏準確的臨床診斷方法的開發(fā)等。因此，為了有效防控甚至徹底消滅ALV，需要大家投入更多的精力，對ALV進行更加深入的研究。