張愛梅,韓雪英,王 嘉,孔維寶,牛世全,朱學(xué)泰

西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,蘭州 730070

植物內(nèi)生菌是在一定階段或全部階段生活于健康植物的組織和器官內(nèi)部的一大類微生物[1]。內(nèi)生菌具有豐富的生物多樣性,對于一種植物而言,從中可分離到的內(nèi)生真菌或細(xì)菌通常為幾種至幾十種,有的甚至可達(dá)幾百種[2]。內(nèi)生菌數(shù)量龐大,種類眾多,包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌等[3]。在同一種植物的根、莖、葉、花、果實和種子中均有內(nèi)生菌被發(fā)現(xiàn),且植物內(nèi)生菌具有一定的植物和組織專一性[4]。

內(nèi)生菌多樣性的研究主要應(yīng)用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù),通過分離、培養(yǎng)等過程從特定的樣品中獲得微生物純培養(yǎng)物,再進(jìn)行菌株的分類鑒定。由于實驗室條件下提供的培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境與微生物所處的自然環(huán)境之間存在很大差異,大量微生物無法通過純培養(yǎng)獲得目標(biāo)菌株。高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展,為內(nèi)生菌多樣性的研究提供了更有效的途徑,可靈敏地探測待測樣品中包括稀少種群在內(nèi)的絕大多數(shù)微生物,能更全面客觀地揭示目標(biāo)環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu),同時獲得定性及相對定量的信息[5]。

中國沙棘(Hippophaerhamnoides)可在貧瘠干旱及高寒環(huán)境生存,根系發(fā)達(dá),且能形成明顯的根瘤,是一種典型的放線菌結(jié)瘤植物,能與弗蘭克氏菌(Frankia)共生結(jié)瘤固氮。研究發(fā)現(xiàn),除弗蘭克氏菌外,沙棘根瘤中還存在大量的非弗蘭克氏內(nèi)共生菌[6-7]。用純培養(yǎng)方法研究沙棘內(nèi)共生菌時還發(fā)現(xiàn),沙棘內(nèi)共生菌具有系統(tǒng)內(nèi)生性和組織專化性[8]。

為了全面了解沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的多樣性,明確根瘤內(nèi)共生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特點及組成,以分布在甘肅馬銜山高寒地區(qū)的中國沙棘根瘤為研究材料,將高通量測序技術(shù)和純培養(yǎng)技術(shù)聯(lián)合使用,以期能更系統(tǒng)地揭示中國沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的多樣性,并獲得具有潛在應(yīng)用價值的內(nèi)共生細(xì)菌資源。同時,比較兩種方法研究結(jié)果的差異,為沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌多樣性的研究與應(yīng)用提供參考,并為更進(jìn)一步開展內(nèi)生共細(xì)菌相關(guān)研究提供方向及有價值的菌株材料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣地為馬銜山自然保護(hù)區(qū),地理位置位于甘肅省蘭州市榆中縣馬坡鄉(xiāng)(海拔2792 m,年平均氣溫3.2℃,經(jīng)緯度： 103°58′42″E, 35°47′21″N)。2016年9月在沙棘根瘤生長期,在人為干擾相對較少的河灘地生長的中國沙棘灌叢典型生境,選取6株中國沙棘植株采集沙棘根瘤,帶回實驗室于4℃冰箱保存,并盡快進(jìn)行根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的分離培養(yǎng)和根瘤總DNA的提取[9]。

1.2 沙棘根瘤表面消毒

選取新鮮幼嫩的沙棘根瘤樣品,除去沙棘根瘤表面的泥沙等雜質(zhì),依次用自來水、蒸餾水和無菌水分別沖洗。然后用75%乙醇和1% NaClO溶液分別進(jìn)行表面消毒,再用無菌水反復(fù)沖洗,收集最后一次沖洗的無菌水進(jìn)行無菌檢測[10]。

1.3 沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的純培養(yǎng)

1.3.1 內(nèi)共生細(xì)菌的分離

沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的分離采用根瘤切片法[11]。采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和加入沙棘根浸出物的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離細(xì)菌；采用高氏I號培養(yǎng)基和加入沙棘根浸出物的高氏I號培養(yǎng)基分離放線菌；采用Qmod和加入沙棘根浸出物的Qmod培養(yǎng)基分離弗蘭克氏菌。用無菌刀片將沙棘根瘤尖端含菌組織切成約1 mm的薄片,分別置于上述培養(yǎng)基的平板中,28℃培養(yǎng)。挑取平板上不同菌落形態(tài)特征的內(nèi)共生細(xì)菌,劃線純化后保存于試管斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 內(nèi)共生細(xì)菌的初步鑒定

沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的傳統(tǒng)鑒定采用形態(tài)觀察和生理生化實驗相結(jié)合的方法。形態(tài)觀察與生理生化特征主要參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》、《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》以及《土壤與環(huán)境微生物研究法》[12-14]。

1.3.3 內(nèi)共生細(xì)菌的分子鑒定

沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌DNA的提取采用堿解法[15],放線菌DNA提取采用微波法[16]。16S rRNA基因擴(kuò)增采用通用引物：27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反應(yīng)體總系為25 μL：引物各1 μL,模板4 μL,Taq MasterMix(Dye)15 μL,加ddH2O至25 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min,95℃變性1 min,56℃退火30 s,72℃延伸2 min,30個循環(huán),最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送去北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測序。

將所得到的序列用NCBI的BLAST進(jìn)行比對,用MEGA7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析；將16S rRNA基因序列相似性在97%以上劃分為同一個操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU),進(jìn)一步根據(jù)公式計算Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。

式中,S代表所有OTUs的總數(shù),pi代表劃分到同一個屬的OTUs數(shù)占總OTUs的百分比[17]。

1.4 沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的高通量測序分析

1.4.1 內(nèi)共生細(xì)菌總DNA提取與16S rDNA-V4區(qū)PCR擴(kuò)增

根瘤內(nèi)共生細(xì)菌總DNA的提取參照彭源東與李志真等采用的CTAB法[18-19]。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的效果。

細(xì)菌16S rDNA-V4區(qū)的PCR擴(kuò)增采用帶Barcode的特異性引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和806R(5′-GCCAATGGACTAHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR擴(kuò)增采用50 μLPCR擴(kuò)增體系,擴(kuò)增反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性5 min,98℃變性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸30 s,25個循環(huán),最后72℃延伸5 min。部分PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,其余樣品-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 文庫構(gòu)建和上機測序

根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣,充分混勻后使用2%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物,對目的條帶使用Qiagen公司的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量,文庫合格后,使用Hiseq 2500 PE250進(jìn)行上機測序。本研究測序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.4.3 高通量測序數(shù)據(jù)處理

將測序得到的原始數(shù)據(jù)截去Barcode和引物序列后進(jìn)行拼接,拼接得到的序列經(jīng)過嚴(yán)格的過濾,并去除其中的嵌合體序列得到最終的有效數(shù)據(jù)。利用Uparse軟件對樣品的全部有效序列在97%水平上進(jìn)行OTU聚類,并篩選出OTU中出現(xiàn)頻率最高的序列作為OTUs代表序列,用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析,并在各個水平上統(tǒng)計樣品的群落組成。高通量測序數(shù)據(jù)處理與分析由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 純培養(yǎng)方法分析中國沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

利用不同培養(yǎng)基從采集的中國沙棘根瘤中分離純化得到17株內(nèi)共生細(xì)菌,所有菌株均可傳代培養(yǎng)。所有菌株培養(yǎng)后,提取其DNA,再將菌株的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序,測序得到的基因序列通過BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的16S rRNA序列進(jìn)行相似性對比,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。

同時進(jìn)行17株菌株的形態(tài)學(xué)觀察和生理生化實驗,將二者結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果結(jié)合進(jìn)行分析,分離到的17株沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌分屬于放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)3個門。在屬分類單元,17株菌株分屬于8個屬,其中：鏈霉菌屬(Streptomyces)4株、韓國生工菌屬(Kribbella)1株、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)1株、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)1株、芽孢桿菌屬(Bacillus)7株、芽生桿菌屬(Bosea)1株、馬賽菌屬(Massilia)1株和沙雷氏菌屬(Serratia)1株；優(yōu)勢屬為芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬。

圖1 基于16S rRNA基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

2.2 高通量測序分析中國沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 樣品復(fù)雜度分析

采用Illumina HiSeq 測序平臺進(jìn)行測序,得到51566條原始數(shù)據(jù),拼接和質(zhì)控后進(jìn)行嵌合體過濾,得到可用于后續(xù)分析的有效序列50234條,其平均長度約422 bp,與16S rDNA-V4區(qū)序列長度基本一致。以97%的一致性將有效序列聚類為1805個OTU。

結(jié)果表明樣品覆蓋度為99.3%,ACE指數(shù)為1318,Chao1指數(shù)為1271,且稀釋曲線趨于平穩(wěn),表明測序數(shù)據(jù)合理可靠。

2.2.2 OTU物種注釋

對OTU代表序列進(jìn)行物種注釋,獲得分類學(xué)信息并分別在各分類單元統(tǒng)計樣本的群落組成,沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌可以注釋到24門、50綱、90目、167科、215屬(表1)。

2.2.3 內(nèi)共生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

在門和屬分類單元進(jìn)行物種分類樹統(tǒng)計,各分類單元相對豐度前10的物種分別如圖所示(圖2)。在門分類單元,沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌主要分布在藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、衣原體門(Chlamydiae)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和柔膜菌門(Tenericutes)等；其中藍(lán)細(xì)菌門、變形菌門、放線菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢門。

表1 各分類單元的序列數(shù)目及群落組成

圖2 物種分類樹Fig.2 Classification tree of microbial speciesCyanobacteria:藍(lán)細(xì)菌門；Actinobacteria：放線菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Proteobacteria：變形菌門；Chlamydiae：衣原體門；Acidobacteria：酸桿菌門；Chloroflexi：綠彎菌門；Tenericutes：柔膜菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Actinobacteria：放線菌綱；Alphaproteobacteria：α-變形菌綱；Gammaproteobacteria：γ-變形菌綱； Bacilli：芽孢桿菌綱；Frankiales：弗蘭克氏菌目；Rhizobiales：根瘤菌目；Pseudomonadales：假單胞菌目；Aeromonadales：氣單胞菌目；Enterobacteriales：腸桿菌目；Xanthomonadales：黃單胞桿菌目；Selenomonadales：月牙單胞菌目；Lactobacillales：乳桿菌目；Bacillales：芽孢桿菌目；Streptomycetaceae：鏈霉菌科；Frankiaceae：弗蘭克氏菌科；Rhizobiace：根瘤菌科；Pseudomonadaceae：假單胞菌科；Succinivibrionaceae：琥珀酸弧菌科；Enterobacteriaceae：腸桿菌科；Xanthomonadaceae：黃單胞菌科；Veillonellaceae：韋榮球菌科；Lactobacillaceae：乳桿菌科；Paenibacillaceae：類芽孢桿菌科；Streptomyces：鏈霉菌屬；Frankia：弗蘭克氏菌屬；Rhizobium：根瘤菌屬；Pseudomonas：假單胞菌屬；Succinivibrio：琥珀酸弧菌屬；Yersinia：耶爾森氏鼠疫桿菌屬；Stenotrophomonas：寡養(yǎng)單胞菌屬；Anaerovibrio：厭氧弧菌屬；Lactobacillus：乳酸桿菌屬；Brevibacillus：短芽孢桿菌屬

在屬分類單元,沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌主要包括弗蘭克氏菌屬(Frankia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、耶爾森氏鼠疫桿菌屬(Yersinia)、厭氧弧菌屬(Anaerovibrio)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、根瘤菌屬(Rhizobium)和寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；優(yōu)勢屬為弗蘭克氏菌屬和假單胞菌屬,相對豐度分別達(dá)到17.7%和7.5%,為沙棘根瘤內(nèi)的絕對優(yōu)勢類群。

2.3 純培養(yǎng)和高通量測序分析中國沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的差異

2.3.1 內(nèi)共生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異

在門、綱、目、科和屬分類單元,純培養(yǎng)方法只檢測到3門、5綱、7目、8科和8屬,而高通量測序共檢測到24門、50綱、90目、167科和215屬(表2)。后者的檢測靈敏度分別是前者的8、10、12.9、20.9倍和26.9倍。這一結(jié)果表明,純培養(yǎng)方法嚴(yán)重低估了沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的物種組成；分類單元越低,高通量測序方法檢測到的微生物物種數(shù)越多,與純培養(yǎng)方法相比具有越明顯的優(yōu)勢。

2.3.2 內(nèi)共生細(xì)菌相對豐度的差異

在門分類單元,比較純培養(yǎng)和高通量測序方法檢測到的根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的相對豐度,結(jié)果發(fā)現(xiàn),純培養(yǎng)方法檢測到的放線菌門和厚壁菌門的內(nèi)生細(xì)菌相對豐度明顯高于高通量測序方法,而變形菌門的相對豐度卻低于高通量測序方法(表3)。藍(lán)細(xì)菌門、變形菌門、放線菌門和厚壁菌門均為高通量測序的優(yōu)勢菌門,藍(lán)細(xì)菌門在純培養(yǎng)時卻沒有分離得到。

表2 純培養(yǎng)與高通量測序檢測到的各分類單元的內(nèi)共生細(xì)菌群落組成

表3 根瘤內(nèi)共生細(xì)菌在門分類單元的相對豐度差異/%

在屬分類單元,比較純培養(yǎng)和高通量測序方法檢測到的根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的相對豐度,發(fā)現(xiàn)純培養(yǎng)方法檢測到的內(nèi)共生細(xì)菌的相對豐度普遍高于其在高通量測序方法中的豐度(表4)。純培養(yǎng)方法分離得到的芽孢桿菌屬的相對豐度為41.2%,而在高通量測序分析中只占0.70%；純培養(yǎng)分離得到的鏈霉菌屬的相對豐度為23.5%,但在高通量測序中只占0.92%；純培養(yǎng)分離得到的擬諾卡氏菌屬和沙雷氏菌屬,高通量測序卻沒有檢測到。相反地,高通量測序檢測到的優(yōu)勢屬弗蘭克氏菌屬(17.7%)和假單胞菌屬(7.5%),純培養(yǎng)方法卻沒有分離得到。

表4 根瘤內(nèi)共生細(xì)菌在屬分類單元的相對豐度差異/%

2.3.3 內(nèi)共生細(xì)菌多樣性差異

將沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的微生物多樣性指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計,結(jié)果表明,基于純培養(yǎng)的根瘤內(nèi)共生細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)為2.462,辛普森指數(shù)為0.754,而高通量測序得到的根瘤內(nèi)共生細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)為4.967,辛普森指數(shù)為0.869,說明高通量測序檢測到的內(nèi)共生細(xì)菌的群落多樣性要高于純培養(yǎng)方法,同時也說明,沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜,群落更為穩(wěn)定。

3 討論

本研究通過純培養(yǎng)和高通量測序方法檢測馬銜山中國沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌,兩種方法都表明中國沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌具有豐富的多樣性。在采用純培養(yǎng)方法檢測時,由于培養(yǎng)條件的影響,只得到相對較少的純培養(yǎng)物,其根本原因可能是由于大量的微生物還未找到合適的培養(yǎng)條件[20]。沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的生長與一些生物因素和非生物因素也有關(guān)系,為了使實驗室培養(yǎng)的營養(yǎng)條件更接近自然環(huán)境,在沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌分離時,還應(yīng)嘗試模擬自然生態(tài)環(huán)境,以利于更多的內(nèi)共生細(xì)菌被分離培養(yǎng)。

本研究中,采用純培養(yǎng)方法檢測到中國沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的優(yōu)勢屬為芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬。劉志強[21]和徐瑞瑞[7]等均對沙棘根瘤中的微生物進(jìn)行過研究,也發(fā)現(xiàn)沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌多樣性豐富,但分離得到的根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的種類與本次研究得到的種類存在一定差異,說明植物內(nèi)共生細(xì)菌多樣性可能受植物種類、地理位置、生長環(huán)境和氣候條件等因素的影響[22]。本研究中馬銜山中國沙棘生長在海拔2800 m左右的高寒區(qū),其根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的多樣性與其所處的特殊生境有關(guān)[23]。

本研究采用高通量測序方法檢測沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌時,優(yōu)勢門為藍(lán)細(xì)菌門、變形菌門、放線菌門和厚壁菌門,并且變形菌門、放線菌門和厚壁菌門的微生物在純培養(yǎng)時也被分離到,說明分類單元越高,純培養(yǎng)和高通量測序方法研究根瘤內(nèi)共生細(xì)菌多樣性的差異越小。藍(lán)細(xì)菌門細(xì)菌分布極廣,在極端環(huán)境中也能生長,還能與一些植物共生[24]。而藍(lán)細(xì)菌門的微生物在本研究中利用純培養(yǎng)方法分離時卻未被分離到,因此,其在中國沙棘根瘤中的存在狀況以及與沙棘之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

本研究在采用高通量測序方法檢測沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌時,優(yōu)勢屬為弗蘭克氏菌屬和假單胞菌屬。弗蘭克氏菌能與沙棘共生形成根瘤[25],是沙棘根瘤內(nèi)的絕對優(yōu)勢菌,其豐度達(dá)到17.7%。但采用純培養(yǎng)方法分離時卻未分離到弗蘭克氏菌,可能因為弗蘭克氏菌在人工培養(yǎng)條件下生長緩慢,離體培養(yǎng)需要2—3周或更長時間,且容易被雜菌污染[26]。本研究在中國沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌分離過程中采用根瘤切片法,培養(yǎng)一段時間后,根瘤切片周圍很快鋪滿生長較快的細(xì)菌菌苔,這也可能是阻礙生長較慢的弗蘭克氏菌的生長繁殖的重要因素[27]。因此,探索合適的培養(yǎng)條件及合適的培養(yǎng)方法,縮短弗蘭克氏菌生長周期,減少弗蘭克氏菌離體培養(yǎng)中的污染,是非常必要的[28]。假單胞菌屬為本研究中高通量測序檢測到的僅次于弗蘭克氏菌的優(yōu)勢菌,其豐度達(dá)到7.5%。假單胞菌屬細(xì)菌廣泛存在于各種生境中,包括植物的根瘤內(nèi)[29],但本研究中利用純培養(yǎng)方法分離時也未分離到此菌,可能與培養(yǎng)條件有關(guān),假單胞菌屬細(xì)菌與中國沙棘的互作關(guān)系也有待深入探究。已有研究也發(fā)現(xiàn),在其他植物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)共生細(xì)菌以假單胞菌屬和芽孢桿菌屬等為最常見的屬[30]。本研究在沙棘根瘤中檢測到的內(nèi)共生細(xì)菌有一部分與上述其他植物內(nèi)共生細(xì)菌相同,說明沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌與其他植物內(nèi)共生細(xì)菌也具有相似性。另外,本研究中純培養(yǎng)分離得到的擬諾卡氏菌屬和沙雷氏菌屬,在高通量測序并未檢測到,可能與高通量測序技術(shù)存在漏檢有關(guān)。

盡管高通量測序能夠更全面的反映中國沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的多樣性,提供更多的生物學(xué)信息,對沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌多樣性研究具有指導(dǎo)意義。但傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法仍為獲取目標(biāo)菌株的基本途徑,在獲取具有潛在應(yīng)用價值的內(nèi)共生細(xì)菌資源,并進(jìn)行深入研究方面具有優(yōu)勢。如純培養(yǎng)方法能分離得到一些具抑菌和促生活性的根瘤內(nèi)共生細(xì)菌,這些內(nèi)共生細(xì)菌產(chǎn)生的具有多種生理活性的代謝產(chǎn)物的開發(fā)具有廣闊的應(yīng)用前景[31]。

為了探明中國沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的多樣性,需要展開進(jìn)一步的資源調(diào)查,收集盡可能多的不同生境宿主來源的菌株,積累豐富的形態(tài)、生理生化指標(biāo),并建立精確可靠的分子特征數(shù)據(jù)庫,更科學(xué)地界定這些內(nèi)共生細(xì)菌的功能和分類地位。將高通量測序和純培養(yǎng)方法相結(jié)合,既可以最大限度的反映沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的多樣性,又能夠有針對性的進(jìn)行純培養(yǎng),收集到根瘤內(nèi)共生細(xì)菌菌種資源,為后續(xù)研究提供材料。

4 結(jié)論

高通量測序和純培養(yǎng)方法都表明中國沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌具有豐富的多樣性,但高通量測序方法能夠較為全面的反映中國沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌的群落組成,而純培養(yǎng)方法僅能夠分離到少數(shù)可培養(yǎng)的中國沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌。

高通量測序和純培養(yǎng)方法檢測中國沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌多樣性時,分類單元越低,高通量測序方法檢測到的微生物物種數(shù)越多,與純培養(yǎng)方法相比具有越明顯的優(yōu)勢。

高通量測序方法獲得的中國沙棘根瘤內(nèi)共生細(xì)菌多樣性信息,為優(yōu)化選擇純培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件,實現(xiàn)有目的地分離特定物種奠定了基礎(chǔ)。