(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 430074)

表面增強(qiáng)拉曼光譜拉曼技術(shù)(Surface-enhanced Raman Spectroscopy,SERS)[1]是通過(guò)化學(xué)或物理吸附方式將被檢測(cè)的目標(biāo)物分子拉到基底表面,通過(guò)改變其極化率[2]或電磁場(chǎng)使被檢測(cè)物質(zhì)的拉曼光譜得到明顯放大[3].對(duì)氨基苯硫酚作為農(nóng)藥、醫(yī)藥、染料的中間體,檢測(cè)其殘留量有重要意義?，F(xiàn)有檢測(cè)方法如電化學(xué)檢測(cè)法[4],此法檢測(cè)需進(jìn)行樣品前處理、耗時(shí)長(zhǎng),敏度低。SERS檢測(cè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于樣品無(wú)需前處理可進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)且檢出限低至ng/L,應(yīng)用在血清檢測(cè)重疾早期篩查、檢測(cè)、治療[5],提供新方法并有望提高檢測(cè)的靈敏度和效率。常規(guī)基底制作方法要用到光刻機(jī)、離子濺射器等價(jià)格昂貴的設(shè)備[6],不具有普適應(yīng),本實(shí)驗(yàn)通過(guò)電化學(xué)陽(yáng)極氧化-原位生長(zhǎng)的方式制備出表面具有高密度hot-spots的SERS活性基底。實(shí)驗(yàn)采用針灸針為固體基板,將其應(yīng)用到小鼠血清樣品的檢測(cè),采樣創(chuàng)口小可實(shí)時(shí)檢測(cè)最低可檢測(cè)出稀釋10-5倍血清樣品,以期可將此SERS基底運(yùn)用到臨床取樣檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用中。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

檸檬酸、氟化氨、硝酸鉀、硝酸銀、對(duì)氨基苯硫酚(4-ATP)乙二醇、乙醇(阿拉丁試劑公司)試劑均為分析純。單輸出直流電源(KPS-6005D深圳市兆信儀器有限公司),熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社JSM-7800F型),拉曼光譜儀(美國(guó)賽默飛公司DXR2XI型)。

1.2 基底制備與表征

準(zhǔn)備3支直徑0.3mm長(zhǎng)度40mm一次性無(wú)菌針灸針，依次放入丙酮、甲醇、去離子水(電阻率>18.25MΩ)中超聲清洗,氮?dú)獯蹈?。精密稱取0.12gNH4F,0.6g檸檬酸,溶解于25mL體積比9∶1的乙二醇去離子水溶液記為電解液A.直徑0.3mm鉑絲為對(duì)電極,針灸針為工作電極,直流電源施加恒壓50V。50min時(shí)取出去離子水清洗,氮?dú)獯蹈煞湃腚娊庖築(3mmol/LAgNO3、3mmol/LKNO3、0.6mgFeCl3)中,負(fù)極為氧化后的針灸針正極為鉑絲電極電壓調(diào)至0.79V,電鍍時(shí)間20min、30min、40min、60min時(shí)取出,SEM進(jìn)行表征、觀察形貌。SERS基底信號(hào)準(zhǔn)確性:編號(hào)為1、2、3,SERS基底浸入5mL 10-6mol/L 4-ATP溶液自組裝30min,各隨機(jī)選取一點(diǎn)測(cè)試,實(shí)驗(yàn)條件：He-Ne氣體激光器,激發(fā)光633nm,能量為1mw,激光照射3s,除去表面污染物,曝光時(shí)間0.05sec掃描次數(shù)為1次。SERS基底信號(hào)重現(xiàn)性:將1號(hào)取出,隨機(jī)選取5點(diǎn),每點(diǎn)掃描3次并在1037～1104cm-1峰面積積分。

1.3 4-ATP檢測(cè)及小鼠血清檢測(cè)

精密稱取4-ATP 0.0125g,乙醇溶液配置成10-2mol/L儲(chǔ)存液,梯度稀釋.準(zhǔn)備小鼠血清樣品記為C0,將其用去離子水(電阻率>18.25MΩ)依次釋成一系列濃度(C0×10-1,C0×10-2,C0×10-3,C0×10-4,C0×10-5)小鼠血清溶液,將制備完成的SERS基底與稀釋液自組裝30min。數(shù)據(jù)采集條件：激發(fā)光633nm,激光能量3mW,照射30s,曝光時(shí)間0.05sec掃描次數(shù)1次。

2 結(jié)果與討論

2.1 制備條件

不銹鋼針灸針氧化后,針體表面會(huì)形成5～20μm的氧化膜,此氧化膜表面的介孔可作為銀離子還原的生長(zhǎng)位點(diǎn)[6]。在Ag+還原過(guò)程中，電解液中添加的少量Fe3+作為陰極去極化劑可避免析氫的極化作用。隨著時(shí)間的增加，陽(yáng)極氧化過(guò)程不斷在加深。直至40min時(shí)可以明顯觀察到針灸針表面均勻的鋪滿一層介孔，這些介孔為后續(xù)Ag+的還原以及3D-AgNPS提供了良好的生長(zhǎng)條件。故50min為陽(yáng)極氧化的最佳條件。

為確定還原條件,將還原時(shí)間定位1h，因?yàn)橄跛徙y溶液的濃度影響Ag(Ⅰ)還原的速度和量有關(guān)，改變硝酸銀溶液的濃度，并確定最佳生長(zhǎng)條件。濃度為3mmol/L銀團(tuán)簇的密度大且均勻，濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致還原速度過(guò)快在基底上易形成塊狀結(jié)構(gòu)，濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致還原時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。故還原過(guò)程中選擇電解液濃度為3mmol/L的硝酸銀溶液為佳。

為確定最佳還原時(shí)間，硝酸銀濃度固定為3mmol/L，電鍍時(shí)間為變量0.5、1、1.5和2h。當(dāng)還原時(shí)間為0.5h有少許銀納米顆粒生成，但密度較低。1h時(shí)大量的Ag+被還原成銀金屬且密度較高。電鍍時(shí)間過(guò)長(zhǎng)Ag枝狀結(jié)構(gòu)明顯增多直至成塊狀顆粒。圖1為陽(yáng)極氧化時(shí)間50min還原時(shí)間(a)20min,(b)30min,(c)40min,(d)60min的SEM圖像。圖1(a),(b)有少許銀納米顆粒生成,密度較低。(c)還原時(shí)間40min,大量Ag+被還原成銀金屬,密度較高。電鍍時(shí)間過(guò)長(zhǎng)Ag枝狀結(jié)構(gòu)成塊狀顆粒(d),此結(jié)構(gòu)非納米數(shù)量級(jí),會(huì)導(dǎo)致金屬局域表面等離子共振[7]轉(zhuǎn)為表面等離子共振[8]使SERS基底活性降低,拉曼信號(hào)增強(qiáng)明顯下降，故采用1h為銀離子還原的最佳時(shí)間。

圖1 AgNO3濃度3mmol/L,氧化50min,還原(a)20min,(b)30min,(c)40min,(d)60min

2.2 信號(hào)準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性

4-ATP SERS圖譜中拉曼位移與文獻(xiàn)比對(duì)可知,1574 cm-1νC-C,1441cm-1、1391cm-1、1311cm-1的拉曼位移可分別歸于b2類型,νC-C+νC-H[8]、νC-C+δC-H[8]、νC-C+δC-H[8]的振動(dòng)。1078cm-1由C-S鍵振動(dòng)產(chǎn)生[9]受各種干擾較小,以1037～11104cm-1范圍峰面積為標(biāo)準(zhǔn)用以檢驗(yàn)重現(xiàn)性。同一實(shí)驗(yàn)條件,不同位置重復(fù)檢測(cè),得樣品信號(hào)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.74%,表明基底信號(hào)重現(xiàn)性良好。

2.3 4-ATP及小鼠血清檢測(cè)

圖2 不同濃度4-ATP SERS光譜圖

圖2顯示,SERS信號(hào)強(qiáng)度隨樣品濃度的降低而減弱,可證明SERS信號(hào)的強(qiáng)度與樣品本身的量有關(guān)。以1037～1104cm-1峰面積和樣品濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得：4-ATP濃度在10-12～10-4mol/L圍內(nèi)的線性方程為Y=5.124X-12.36,相關(guān)系數(shù)r=0.989線性關(guān)系良好,檢出限可低至10-12mol/L。

圖3 小鼠血清濃度為C0,C0×10-1,C0×10-2, C0×10-3,C0×10-4,C0×10-5SERS光譜圖

應(yīng)用SERS手段檢測(cè)血清樣品時(shí)要特別注意：若激發(fā)樣品的能量過(guò)高則會(huì)引起熒光效應(yīng)導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)過(guò)低或信號(hào)被熒光信號(hào)所覆蓋而檢測(cè)不到信號(hào)[10]。小鼠血清檢測(cè)過(guò)程中,未稀釋血清溶液為參考標(biāo)準(zhǔn)。逐級(jí)稀釋5份樣品與未稀釋樣品作為檢測(cè)對(duì)象,研究基底對(duì)于低濃度的小鼠血清溶液的檢測(cè)靈敏度。圖3所示,隨小鼠血清濃度降低,基底檢測(cè)樣品SERS信號(hào)減弱。如570cm-1,980cm-1,1000cm-1及1280cm-1隨著樣品稀釋倍數(shù)增加SERS信號(hào)強(qiáng)度明顯降低1600cm-1和1700cm-1波數(shù)位移隨著血清稀釋倍數(shù)增加逐漸歸于一個(gè)拉曼位移,當(dāng)稀釋濃度為C0×10-5時(shí)1600cm-1和1700cm-1不再明顯。綜上所述,此基底可應(yīng)用于檢測(cè)小鼠血清樣品,最低可檢測(cè)到原樣品稀釋10-5倍。

3 結(jié)論

本文采用電化學(xué)腐蝕-生長(zhǎng)方法制備了不銹鋼針灸針

SERS活性基底?；妆砻鏄?shù)枝狀3DAgNPS結(jié)構(gòu)為致密的Hotspots,提升了基底增信號(hào)的性能.此方法制備的SERS基底采集信號(hào)快速、準(zhǔn)確且靈敏度高,可滿足直接檢測(cè)小鼠血清的要求且使用設(shè)備簡(jiǎn)單、花費(fèi)低、為制作微創(chuàng)SERS活性基底并應(yīng)用于臨床取樣及檢測(cè)提供了新思路。