, ，，

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,湖南 長沙 410128；2.桃源縣第三中學(xué),湖南 桃源 415701；3.湖南文理學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,湖南 常德 415000)

我國小麥在種植面積、總產(chǎn)量和消費量上，皆居世界首位，是我國第三大糧食作物。小麥的蛋白質(zhì)占小麥籽粒重量的8%～20%，分為麥谷蛋白和醇溶蛋白，它們是決定面團彈性和延伸性的物質(zhì)基礎(chǔ)。面食的品質(zhì)優(yōu)劣主要依賴于小麥籽粒貯藏蛋白——面筋蛋白的結(jié)構(gòu)及其相互作用。用水或者稀鹽溶液沖洗面團，剩下的物質(zhì)稱為面筋。面筋中有80%由蛋白質(zhì)組成，它們稱為面筋蛋白，由醇溶蛋白和麥谷蛋白組成[1]。面筋蛋白之間通過很強的共價鍵和非共價鍵相互作用，賦予面團粘彈特性[2]。醇溶蛋白是單體蛋白，主要影響面團的粘性和延展性；而麥谷蛋白可以形成多聚體蛋白，主要影響面團的彈性，并最終影響小麥面粉的加工品質(zhì)。因此對麥谷蛋白組成、結(jié)構(gòu)和功能的研究一直是小麥品質(zhì)改良領(lǐng)域的研究熱點[3]。麥谷蛋白根據(jù)分子量大小可分為高分子量麥谷蛋白(HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白(LMW-GS)。LMW-GS基因沒有內(nèi)含子，是一個單一的開放閱讀框，其編碼序列一般含有900～1200個堿基，其編碼的成熟蛋白亞基的分子量大小約30～45kDa。重復(fù)區(qū)域一般以PPFSQQ為主要的重復(fù)單元，重復(fù)單元的個數(shù)直接影響著LMW-GS分子量的大??；C-I區(qū)比較保守，是半胱氣酸富集的區(qū)域，C-II區(qū)則是脯氨酸富集的區(qū)域，序列結(jié)構(gòu)不保守，C-III區(qū)域含有一個半胱氨酸，其氨基酸序列也比較保守[4]。我國小麥蛋白質(zhì)含量并不低，經(jīng)過多年定向選擇，也不乏優(yōu)質(zhì)亞基，但面筋質(zhì)量仍然較差，說明貯藏蛋白組成不合理，組份比例及絕對含量可能是主要問題。谷蛋白總量及組份含量主要受品種遺傳特性決定，而麥谷蛋白含量與面團特性和面包加工品質(zhì)高度相關(guān)，可以通過培育谷蛋白高表達量的品種，提高品質(zhì)性狀的環(huán)境穩(wěn)定性。本研究以河?xùn)|烏麥為實驗材料，對其低分子量麥谷蛋白編碼基因進行生物信息學(xué)分析，為小麥低分子量谷蛋白基因研究增添新內(nèi)容，為優(yōu)化小麥加工品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

培養(yǎng)保存于湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院種質(zhì)資源庫的河?xùn)|烏麥的黃化幼苗提取其總基因組DNA。

1.2 研究方法

利用CTAB法提取供試材料總基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠檢測DNA質(zhì)量。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已報道的低分子量谷蛋白基因序列的保守區(qū)，分別設(shè)計可擴增低分子量谷蛋白基因完整編碼區(qū)的兼并性引物，對其進行PCR擴增，1%瓊脂糖電泳檢測擴增結(jié)果，用PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)對目的片段進行回收純化。

將回收純化的PCR產(chǎn)物送專業(yè)公司進行測序，本研究序列測定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。測序結(jié)果比較分析采用NCBI網(wǎng)址中的Blast(http://www.ncbi.nlm.nib.gov/BLAST/)程序進行；DNA序列分析、系統(tǒng)演化、蛋白質(zhì)序列分析等用DNAMAN8.0軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

對提取獲得的河?xùn)|烏麥總基因組DNA進行擴增，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂電泳進行檢測，結(jié)果表明擴增出1條約920bp的亮帶(圖1)。

2.2 核酸序列信息

通過測序，獲得一條長918bp，分子量為565.94kDa的核苷酸序列(圖2)。

序列包括275個腺嘌呤核糖核苷酸(A)，占整條DNA核苷酸鏈的30.0%；294個胞嘧啶核糖核苷酸(C)，占32.0%；156個鳥嘌呤核糖核苷酸(G)，占17.0%；193個胸腺嘧啶核糖核苷酸(T)，占21.0%(表1)。

該DNA序列GC含量約為49.0% ，AT含量約為51.0%。其中GC在序列含量越高，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，在PCR擴增過程中所需要的退火溫度就越高。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 表1 核苷酸序列的各種堿基的數(shù)目及百分數(shù)

堿基堿基數(shù)目所占百分比/%A27530.0T19321.0C29432.0G15617.0A-T46851.0G-C45049.0

圖2 河?xùn)|烏麥低分子量谷蛋白基因編碼的核酸序列

2.3 核酸限制性酶切圖譜

在河?xùn)|烏麥低分子量谷蛋白編碼的基因核酸序列中通過DNAMAN用了117種常見酶進行篩選。共篩選出18個限制性酶切位點，其中包括了17種酶，ApaBI在序列中有兩個酶切位點，分別在47bp和566bp處，其它16種酶Acc65I，AlwNI，Asp718I，BbvII，BglI，Bpu1102I，Bsc91I，Bsp1407I，Eco31I，EspI，KpnI，MstI，NcoI，SpeI，XcmI，XmnI在序列中各有一個位點(圖3)。

圖3 河?xùn)|烏麥低分子量谷蛋白編碼基因DNA限制酶切圖譜

2.4 核酸序列比對堿基同源性分析

利用NCBI對河?xùn)|烏麥低分子量谷蛋白基因序列進行基因比對，發(fā)現(xiàn)有9條基因序列與河?xùn)|烏麥基因的相似性達到99%。隨機選取相似性較高的8條序列進行比對分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與河?xùn)|烏麥相似性最高的是普通小麥，兩者同源性最高，其次是烏拉爾圖小麥、Taeniatherum crinitum、節(jié)節(jié)麥(表2)。

表2 河?xùn)|烏麥LMW-GS基因序列的同源性比對

用這8條核酸序列和研究的目的核算序列利用DNAMAN軟件進行堿基同源性比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。

結(jié)果顯示FJ549935和KM085255的該基因堿基排列順序及種類極其相似，具有很高的同源性，最先聚為一類。說明這2個基因序列可能是由于環(huán)境等因素變化引起該種群的基因頻率發(fā)生了變化，即趨異進化而形成的兩個基因。它們擁有一個共同的祖先，因此可聚為一類。而河?xùn)|烏麥的低分子量谷蛋白基因最先與FJ549935，KM085255，KX879103，F(xiàn)J755302，KU522466聚成一類，最后才與JX828341聚成一類，說明該河?xùn)|烏麥的基因與FJ549935，KM085255，KX879103，F(xiàn)J755302，KU522466親緣關(guān)系較近，與后者親緣關(guān)系較遠。

圖4 系統(tǒng)發(fā)育樹

利用DNAMAN軟件對同源相似性程度較高的8個序列進行堿基同源性分析(圖5)。堿基高度保守的區(qū)域：位點在388～403bp、415～429bp、447～470bp、491～506bp、508～524bp、620～644bp、665～719bp、775～790bp處堿基序列完全一致，所以這幾種不同生物體的不同基因在這些區(qū)域內(nèi)是高度保守的DNA序列，不易突變。堿基發(fā)生缺失的區(qū)域：EF190322在347～352bp處，KM085255在534～536bp處都發(fā)生了一個堿基的缺失，而在348～350bp處7條序列都出現(xiàn)了堿基的基因缺失。

目的序列在區(qū)域中一共發(fā)生了5處堿基突變。在490bp，A突變成C，在539bp，C突變成T，在556bp，G突變成C，在663bp，A突變成G，591bp處，A突變成G。

圖5 基因核酸序列比對

2.5 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)復(fù)雜空間構(gòu)象的物質(zhì)基礎(chǔ)，是蛋白質(zhì)可以行使各種各樣生命活動功能的前提。利用DNAMAN分析軟件對目的核酸序列編碼的氨基酸序列進行分析。其中Gln谷氨酰胺的含量最高，為35.00%，其次Pro脯氨酸含量較高，為10.34%，Asp天冬氨酸含量最低，僅為0.33%(圖6)。

對該序列所翻譯的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)則卷曲(coils)，主要分布于第20～154個氨基酸片段內(nèi)，有零星片層結(jié)構(gòu)。其中氨基酸為306個，分子量大小為34588.0kDa(圖7)。

圖6 河?xùn)|烏麥低分子量谷蛋白編碼基因氨基酸序列信息

圖7 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.6 蛋白質(zhì)疏水性分析

利用DNAMAN分析軟件對該序列編碼的氨基酸序列進行了疏水性分析，結(jié)果顯示，1～25bp，256～306bp處為疏水性，26～120bp，190～250bp處為親水性(圖8)。

圖8 蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果

2.7 蛋白質(zhì)信號肽分析

利用DNAMAN分析軟件對該序列編碼的氨基酸序列進行了分析，結(jié)果得出河?xùn)|烏麥蛋白質(zhì)信號肽序列為MKTFLVFALLAVVATSAIA(圖9)。

圖9 蛋白質(zhì)信號肽序列

3 結(jié)論與討論

利用PCR擴增技術(shù)，從河?xùn)|烏麥基因中分離得到一條長度為918bp的低分子量谷蛋白編碼基因序列，其上共有18個酶切位點，GC含量為49.0%。

利用NCBI網(wǎng)站對該段序列BLAST同源比對結(jié)果表明，該基因與來自于普通小麥低分子量麥谷蛋白中得亞基GluA3-21和GluA3-1基因高度相似，相似值達到99%。系統(tǒng)演化分析表明，該基因與編號1、2、3、4、5的序列先聚到一類，表明這6個基因片段的堿基序列同源程度高，其親緣關(guān)系較近。

利用DNAMAN分析軟件對該核苷酸序列編碼得氨基酸序列進行分析，結(jié)果得出河?xùn)|烏麥蛋白質(zhì)信號肽序列為MKTFLVFALLAVVATSAIA。進行人工翻譯后，得到306個氨基酸，分子量大小為34588.0kDa。其中，含量最高的氨基酸為Gln谷氨酰胺，含量為35.00%，周琴等人[5]研究中表明，隨著谷氨酰胺水平的提高，籽粒的淀粉含量呈現(xiàn)遞減趨勢，與淀粉含量變化趨勢相反，籽粒蛋白質(zhì)的含量隨谷氨酰胺供應(yīng)水平的的提高而迅速上升，而對于單個籽粒中的淀粉和蛋白質(zhì)的積累量有促進作用，但是對蛋白質(zhì)的促進作用大于淀粉的促進作用。二級結(jié)構(gòu)分析表明，該蛋白質(zhì)主要由卷曲(coil)結(jié)構(gòu)組成，在第20-154號氨基酸區(qū)段分布最為密集，其次為片層結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)主要影響小麥的加工品質(zhì)。