， ，，，， ，

(大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116605)

從自然界尋找高效的能夠抗人類病原菌、動物病原菌的的化合物一直是研究者的熱點之一，如何從天然資源中篩選和研發(fā)新型的抗生素，也是最近研究的趨勢。海洋微生物由于生存環(huán)境具有低溫、高壓、黑暗等特殊性，可能會產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、作用機(jī)制獨特的活性代謝產(chǎn)物，因此成為了近年來研究的熱點之一[1-3]。

本實驗以9種人類和動物致病菌致病菌(大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，白色念珠菌，弧菌，銅綠假單胞菌，沙門氏菌，肺炎克雷伯菌，屎腸球菌，鮑曼不動桿菌)為指示菌，研究海洋微生物的抑菌譜，并進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步研究其相關(guān)次級代謝產(chǎn)物以及其抗菌活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)，其應(yīng)用前景廣闊豐富。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

海洋沉積物樣品采集泥樣為中國第六次北極考察沉積物樣品。

指示菌：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、弧菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯菌、屎腸球菌和鮑曼不動桿菌，實驗室保藏。

1.1.2 試劑

PCR試劑，購自大連寶生物公司。其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g·L-1，瓊脂20g，氯化鈉5g，去離子水1000mL，pH約為7.0。

營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基：18g，瓊脂20g，去離子水1000mL，pH約為7.0。

腦心浸液肉湯(BHI)培養(yǎng)基：38.5g，瓊脂20g，去離子水1000mL，pH約為7.0。

MRS培養(yǎng)基：52.2g，瓊脂20g，去離子水1000mL，pH約為7.0。

1.1.4 儀器與設(shè)備

ZWY-A2102C雙層可編程恒溫?fù)u床，上海智誠分析儀器制造有限公司；BSA224S電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SW-CJ-2FD 潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MT-180B 生化恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DHG-9070A 電熱恒溫干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HVE-50 高壓滅菌器，日本HIRAYAMA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海洋微生物的分離

菌株的分離采用涂布平板法，具體操作如下：稱取海洋沉積物樣品0.5 g，加入60%的海水4.5 mL，混勻后靜置2 h，取0.5 mL混合物，加入4.5 mL海水中，梯度稀釋成7個不同的濃度，取10-7至10-4的稀釋濃度，每個濃度取樣50 μL，用玻璃棒在培養(yǎng)皿上涂布。將培養(yǎng)皿放在培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)1～2 d。然后用接種針挑取形態(tài)不同的單菌落，在培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)2～3 d，分離出單菌落[4]。

1.2.2 制備海洋微生物粗發(fā)酵液

將菌株按0.1%的接種量接種到海水配制的200mL的LB培養(yǎng)基中， 搖床培養(yǎng)24h，(37℃，180 r/min)，離心10 min(6000 r/min、4℃)，取上清。然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃下旋蒸至干，用藥匙摳出，加入3mL超純水，將濃縮液經(jīng)0.22 μm無菌微孔濾膜過濾，得到粗發(fā)酵液。

1.2.3 抑菌譜的測定

采用瓊脂擴(kuò)散法測定發(fā)酵液對9種病原微生物(大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，白色念珠菌，弧菌，銅綠假單胞菌，沙門氏菌，肺炎克雷伯菌，屎腸球菌，鮑曼不動桿菌)的抑菌活性。

6種常見病原微生物(大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，白色念珠菌，弧菌，銅綠假單胞菌，沙門氏菌)應(yīng)用LB培養(yǎng)基；肺炎克雷伯菌應(yīng)用NB培養(yǎng)基；鮑曼不動桿菌應(yīng)用BHI培養(yǎng)基；屎腸球菌應(yīng)用MRS培養(yǎng)基。

微波爐將培養(yǎng)基融化后，室溫放置至40℃左右，接入100μL的病原微生物，輕搖混勻后倒平板，待平板凝固后用9mm的打孔器打孔，量取300μL海洋微生物的粗發(fā)酵液，加入打好的孔中，37℃培養(yǎng)24 h后，用游標(biāo)卡尺測量每個抑菌圈的直徑。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 菌種的鑒定

將挑選的抑菌效果好的菌株進(jìn)行平板劃線法進(jìn)行活化，活化產(chǎn)物送到寶生物公司進(jìn)行鑒定。將測序結(jié)果在GenBank中，通過BLAST進(jìn)行比對，獲得相似度較高的序列。將此序列與所測序列通過ClustalX進(jìn)行比對，最后利用MEGA 6.0軟件，構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定該菌株的分類地位[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌譜測定結(jié)果

11株海洋細(xì)菌的抑菌譜測定結(jié)果如表1所示(注：打孔器直徑9mm)。由表1可以看出，65號菌株具有較廣的抑菌譜，對大腸桿菌，沙門氏菌，弧菌，銅綠假單胞菌，鮑曼不動桿菌表現(xiàn)為低度敏感；對肺炎克雷伯菌表現(xiàn)為中度敏感。

表1 抑菌譜測定結(jié)果匯總

注：+低敏；++高敏；+++極敏

2.2 65號菌株的鑒定結(jié)果

將序列同NCBI基因庫里面記載的所有己測定生物的Nucleotide collection比較，根據(jù)供試系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，65號菌株為芽孢桿菌。

圖1 65號菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

本實驗采用瓊脂擴(kuò)散法研究了11種來源于北冰洋沉積物的海洋細(xì)菌對9種人類和動物致病菌(大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，白色念珠菌，弧菌，銅綠假單胞菌，沙門氏菌，肺炎克雷伯菌，屎腸球菌，鮑曼不動桿菌)的抑菌譜。發(fā)現(xiàn)65號菌株具有較廣的抑菌譜，對大腸桿菌，沙門氏菌，弧菌，銅綠假單胞菌，鮑曼不動桿菌表現(xiàn)為低度敏感；對肺炎克雷伯菌表現(xiàn)為中度敏感。經(jīng)過鑒定，確定其為芽孢桿菌。

隨著畜禽規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等已成為畜禽養(yǎng)殖場的主要病原菌，由這些病原性引起的疾病成為畜禽規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的常見病[6-7]。而大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌等也會引起人類的疾病。本實驗篩選出的65號菌株，來源于深海，有可能會產(chǎn)生不同于陸生微生物的特殊的抑菌活性物質(zhì)。具體有待于進(jìn)一步的研究。