王 慧，楊 俊，杜麗飛，邱美珍，周望平，劉伯承，彭苗苗2，

（1.湖南美神育種有限公司，湖南 株洲 412000；2.湖南鑫廣安農(nóng)牧股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410129；3.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410131）

口蹄疫（Foot-and-mouth Disease,FMD）是由口蹄疫病毒引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要侵害偶蹄動(dòng)物，被國(guó)際獸醫(yī)局（OIE）列為A類(lèi)傳染病[1]，我國(guó)也將該病列為一類(lèi)傳染病。它具有很強(qiáng)的傳染性，可以通過(guò)空氣等多種媒介進(jìn)行傳播，易感動(dòng)物也可以通過(guò)消化道、呼吸道、人工授精、外傷接觸等多種方式感染病毒，發(fā)病率高達(dá)100%。目前，豬口蹄疫的流行毒株主要有O型、A型和亞洲Ⅰ型，而湖南省以O(shè)型和A型為主。因?yàn)榭谔阋吒餮逍烷g交叉保護(hù)性差，為減少免疫次數(shù)，降低勞動(dòng)強(qiáng)度，采用O型和A型口蹄疫二聯(lián)苗進(jìn)行免疫逐漸成為大多豬場(chǎng)的首選和趨勢(shì)。為合理安排口蹄疫二聯(lián)苗的免疫，本試驗(yàn)于2017年3—12月選擇一家規(guī)模豬場(chǎng)，對(duì)仔豬O型和A型口蹄疫母源抗體進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，了解其消長(zhǎng)規(guī)律的同時(shí)，還開(kāi)展首免、二免及三次免疫后抗體水平評(píng)估，確定了最佳首免、二免和三免時(shí)間，按此免疫程序，能較好發(fā)揮口蹄疫二聯(lián)苗的免疫效果。該試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)于選擇O型和A型二聯(lián)苗作為口蹄疫免疫防控的豬場(chǎng)有很好的指導(dǎo)作用，為臨床使用提供了數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 口蹄疫O/A型二價(jià)滅活苗，生產(chǎn)廠家為某股份有限公司。

1.1.2 診斷試劑 口蹄疫病毒O型特異性抗體固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA（SPCE）檢測(cè)試劑盒，口蹄疫病毒A型特異性抗體固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA（SPCE）檢測(cè)試劑盒，生產(chǎn)廠家為倫巴第及艾米利亞-羅馬涅大區(qū)的動(dòng)物疾病預(yù)防實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)為170404B。

1.1.3 試驗(yàn)豬 選擇抗體水平合格并整齊度好的母豬所產(chǎn)仔豬，均為杜長(zhǎng)大三元雜種豬，該場(chǎng)仔豬基本在21日齡斷奶。

1.2 方法

1.2.1 豬場(chǎng)免疫方案 仔豬：35日齡左右首免，60日齡左右二免，110日齡左右三免；經(jīng)產(chǎn)公母豬：每年3、9、10、12月的每月下旬普免1次，劑量均為2毫升/頭。

1.2.2 血清采集 未免疫：選擇抗體水平合格的母豬所產(chǎn)仔豬，且仔豬未進(jìn)行口蹄疫免疫，采集其0、7～9、14～16、21～23、28～30、35～37、42～44、49～51、56～58日齡仔豬全血；免疫后：隨機(jī)采集首免后30天（58～70日齡）、二免后 30天（90～100日齡）、二免后60天（120～130日齡）、三免后60天（150～160日齡）全血，分離血清置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗體檢測(cè)方法 按照抗體檢測(cè)試劑盒步驟進(jìn)行操作分析。

1.2.4 試劑盒原理 ELISA微孔板預(yù)先包被有口蹄疫病毒O（A）型抗原，該抗原可被同源的特異性單抗（MAb）所捕獲，將適當(dāng)稀釋的待檢血清與被捕獲的抗原進(jìn)行孵育，存在于樣品中的特異性抗體最終與抗原結(jié)合，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的口蹄疫病毒O型（A型）MAb，其與同源抗原的反應(yīng)將被預(yù)先結(jié)合到該抗原的陽(yáng)性血清抗體所阻斷，而如果樣品為陰性的話，酶標(biāo)單克隆抗體將可與口蹄疫病毒抗原結(jié)合。然后加TMB進(jìn)行顯色反應(yīng)后再加入終止液，測(cè)其OD值。

1.2.5 ELISA判定標(biāo)準(zhǔn) 豬口蹄疫病毒O型VPI合成肽ELISA抗體檢測(cè)試劑盒：1）試驗(yàn)成立條件：陽(yáng)性對(duì)照孔OD450值應(yīng)介于0.9～2.5之間，陰性對(duì)照孔OD450值均應(yīng)≤0.15；2）臨界值=陽(yáng)性對(duì)照孔 OD450均值×0.17；3）待檢血清測(cè)定OD450值≥臨界值者判定為陽(yáng)性；待檢血清測(cè)定OD450值＜臨界值者判定為陰性。

口蹄疫病毒O型特異性抗體固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA（SPCE）檢測(cè)試劑盒結(jié)果計(jì)算：阻斷率%=100-（血清OD/陰性對(duì)照平均OD值）×100；檢測(cè)有效性：陰性對(duì)照OD值必須≥1；陽(yáng)性對(duì)照血清的阻斷率在1/10稀釋時(shí)應(yīng)≥90%，在1/30稀釋時(shí)應(yīng)＞50%；結(jié)果判定：阻斷率≥50%時(shí)為陽(yáng)性，阻斷率＜50%時(shí)為陰性，陽(yáng)性為免疫合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 未免疫仔豬母源抗體水平

表1的檢測(cè)結(jié)果顯示，剛出生的仔豬沒(méi)有獲得母源抗體，口蹄疫O型抗體陽(yáng)性率為0，吮吸母乳后開(kāi)始獲得母源抗體，在7～9日齡時(shí)抗體陽(yáng)性率達(dá)到77.8%，14～16日齡陽(yáng)性率為94.4%，在3周齡期間抗體達(dá)到最高水平，陽(yáng)性率為100%，后母源抗體開(kāi)始逐漸降低，但直到35～37日齡抗體陽(yáng)性率還有83.3%，42～44日齡抗體陽(yáng)性率為72.2%，51日齡后抗體陽(yáng)性率下降到50%以下，未達(dá)到農(nóng)業(yè)部規(guī)定的免疫合格率≥70%，處于受感染風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)。

表1 免疫前仔豬O型口蹄疫母源抗體檢測(cè)情況

表2的檢測(cè)結(jié)果顯示，剛出生的仔豬口蹄疫A型抗體陽(yáng)性率為0，吮乳后開(kāi)始獲得母源抗體，但較O型口蹄疫抗體水平上升得慢一些，在7～9日齡時(shí)抗體陽(yáng)性率才55.6%，14～16日齡陽(yáng)性率為83.3%，在21日齡期間抗體達(dá)到最高水平，陽(yáng)性率為88.9%，一直持續(xù)到30日齡，后母源抗體開(kāi)始逐漸降低，35～37日齡抗體陽(yáng)性率已經(jīng)下降到66.7%，42～44日齡抗體陽(yáng)性率為50%，50日齡后抗體水平下降到了38.9%，56～59日齡時(shí)母源抗體水平已經(jīng)非常低了，抗體陽(yáng)性率只有27.8%。

表2 免疫前仔豬A型口蹄疫母源抗體檢測(cè)情況

2.2 首免和二免后抗體水平

從表3和表4可以看出，本場(chǎng)選擇在35日齡左右進(jìn)行首次免疫，免疫后30天即58～70日齡豬口蹄疫O型抗體陽(yáng)性率才66.7%，離散度也較高，為36%；但豬口蹄疫A型抗體陽(yáng)性率達(dá)到了94.4%，整齊度也較好。在二免后30天即90～100日齡檢測(cè)血清，豬口蹄疫O型抗體陽(yáng)性率達(dá)到了100%，離散度只有8%；同時(shí)豬口蹄疫A型抗體陽(yáng)性率仍處于高水平為94.4%，且離散度相較于第1次檢測(cè)有所降低。120～130日齡再次檢測(cè)時(shí)，兩種抗體水平均有所下降，但O型抗體水平仍處于很高的狀態(tài)，陽(yáng)性率為94.4%，A型抗體水平下降到了77.8%。可能是由于二次免疫后時(shí)間間隔稍長(zhǎng)，而三次免疫后產(chǎn)生的抗體不到高峰值。最后在110日齡左右進(jìn)行3次免疫，150～160日齡時(shí)兩種抗體陽(yáng)性率均達(dá)到了100%，且阻斷率平均值均大于80%。確保斷奶肥育豬對(duì)豬口蹄疫O型和A型野毒的抵抗力。

表3 免疫后O型口蹄疫抗體水平情況

表4 免疫后A型口蹄疫抗體水平情況

3 討論

規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)均是以群體免疫的理念進(jìn)行疫苗免疫，在進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)時(shí)，抽樣要根據(jù)豬場(chǎng)具體生產(chǎn)模式、檢測(cè)目的等設(shè)計(jì)合理的采樣方案，因此獲得的檢測(cè)數(shù)據(jù)也是代表一個(gè)群體的免疫狀態(tài)。本次采樣豬場(chǎng)嚴(yán)格執(zhí)行全進(jìn)全出和分區(qū)飼養(yǎng)。豬群轉(zhuǎn)入下一個(gè)生產(chǎn)區(qū)時(shí)按同一欄或同一棟豬群同時(shí)轉(zhuǎn)入相應(yīng)的欄舍飼養(yǎng)，豬的疫苗免疫也是按欄或棟為單位進(jìn)行免疫。本研究采樣方案是按豬場(chǎng)實(shí)際生產(chǎn)流程進(jìn)行，采集的每個(gè)日齡階段樣品為免疫時(shí)間是同一天的同一批豬，所以初生日齡有相應(yīng)的跨度，按此采樣方式檢測(cè)的數(shù)據(jù)相應(yīng)代表了該批次豬群整體抗體水平。因此得到的檢測(cè)結(jié)果更符合規(guī)模化豬場(chǎng)生產(chǎn)流程和免疫接種操作方案，對(duì)免疫程序的制定有更現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義[2]。

由于豬胎盤(pán)是上皮絨毛膜類(lèi)型，豬在胎兒時(shí)期不能從母體獲得母源抗體，新生仔豬通過(guò)吮吸初乳經(jīng)消化道吸收獲得母源抗體[3]。母源抗體保護(hù)初生仔豬免受病原侵襲，在提高仔豬抗病力和成活率方面發(fā)揮重要作用。但它的存在對(duì)仔豬也有兩面性，既可以保護(hù)仔豬免受病原感染，同時(shí)較高的母源抗體又會(huì)降低疫苗免疫效果。從表1和表2可以看出，仔豬在出生吮乳后均獲得了較高的母源抗體，直到21日齡到30日齡時(shí)達(dá)到持續(xù)高峰，但相比較而言，仔豬獲得口蹄疫O型母源抗體較高，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，50日齡左右抗體陽(yáng)性率還有50%，而口蹄疫A型母源抗體在43日齡左右就降到了50%，由于免疫的是口蹄疫O/A二價(jià)滅活苗，為了避開(kāi)口蹄疫O型母源抗體的干擾，又要考慮確保能得到有效抵抗A型口蹄疫野毒感染的能力，避免免疫空白，確定在45日齡左右進(jìn)行首次免疫比較合理，同時(shí)將二免、三免時(shí)間相應(yīng)推后。再結(jié)合表3和表4的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，58～70日齡口蹄疫O型抗體陽(yáng)性率只有66.7%，而A型抗體陽(yáng)性率達(dá)到了94.4，很大原因是O型高母源抗體水平干擾了疫苗免疫效果，同時(shí)印證了本場(chǎng)在35日齡首次免疫是不合理的。

此次檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該場(chǎng)經(jīng)過(guò)3次免疫后肥育豬群口蹄疫O型和A型抗體水平都達(dá)到了很高的水平，在150日齡左右抗體陽(yáng)性率均達(dá)到了100%，整齊度好，阻斷率平均值高，都在80%以上（表3和表4），說(shuō)明采取3次免疫已經(jīng)是相對(duì)安全的免疫次數(shù)了，足夠保護(hù)各個(gè)階段的肥育豬群抵抗外來(lái)病原的入侵。

根據(jù)相關(guān)報(bào)道[2，4-5]，不同豬場(chǎng)豬O型口蹄疫的首次免疫時(shí)間各有不同，從25日齡到60日齡不等。因此確定首免時(shí)間應(yīng)根據(jù)自身豬場(chǎng)的免疫狀況及監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)而定，同時(shí)避開(kāi)與其他疫苗的免疫時(shí)段，制定切合實(shí)際生產(chǎn)的免疫程序。