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(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所；腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421001)

1 LncRNA

LncRNA是一類長度>200個核苷酸的RNA分子，最初在2002年由岡崎等人在小鼠中通過大規(guī)模測序發(fā)現(xiàn)并首次報道。由于lncRNA沒有明確的開放閱讀框架，它不參與或很少編碼蛋白質(zhì)，使其在發(fā)現(xiàn)時就被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄的“噪音”。LncRNA經(jīng)歷剪接，聚腺苷酸化和5′加帽，從而與mRNA具有相似的結(jié)構(gòu)，但lncRNA顯示出與mRNA明顯不同的特征，即lncRNA具有較少數(shù)量的外顯子和較高的組織特異性[1]。根據(jù)LncRNA在基因組的位置可以分為：(1)反義lncRNA；(2)內(nèi)含子非編碼RNA；(3)基因區(qū)間的lncRNA；(4)啟動子相關(guān)lncRNA；(5)非翻譯區(qū)lncRNA。LncRNA可與DNA，RNA和蛋白質(zhì)其中一種或多種相互作用，可大致分為：(1)lncRNA通過海綿吸附miRNA，從而調(diào)控靶基因表達(dá)；(2)lncRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合，調(diào)控蛋白質(zhì)功能；(3)作為結(jié)構(gòu)組分，與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合物，例如lncRNA與蛋白質(zhì)復(fù)合物，可結(jié)合到基因啟動子區(qū)域并調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄；(4)干擾鄰近蛋白編碼基因的表達(dá)；(5)抑制RNA 聚合酶Ⅱ，或介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)和組蛋白修飾，從而影響基因表達(dá)；(6)lncRNA可與基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補雙鏈，并在Dicer酶作用下生成內(nèi)源性的小干擾RNA(Small interfering RNA ；siRNA)，以調(diào)控基因的表達(dá)水平；(7)結(jié)合在特定蛋白上從而改變該蛋白的胞質(zhì)定位[2]。近年來，隨著lncRNA成為研究熱點，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些異常表達(dá)的lncRNA在各種癌癥中扮演著重要的角色，如肝細(xì)胞癌(LncRNA-HEIH)，乳腺癌(lncRNA-HOTAIR)，前列腺癌(PlncRNA-1)和非小細(xì)胞肺癌(LncRNA-MALAT1)，已經(jīng)證實這些lncRNA參與腫瘤的進(jìn)程并且有望成為腫瘤標(biāo)志物。而lncRNA在DLBCL中的作用也不斷被報道。

2 LncRNA與DLBCL發(fā)病機(jī)制的關(guān)系

2017年世界衛(wèi)生組織預(yù)估美國2018年淋巴瘤的新發(fā)病人數(shù)及死亡人數(shù)中，NHL占比90%以上，而DLBCL是來源于B細(xì)胞的NHL，是成人NHL中最常見的類型，占所有NHL的35%～40%，占全球侵襲性淋巴瘤的80%以上[3]。根據(jù)DLBCL發(fā)生的細(xì)胞來源，可以將其分為二種亞型：(1)生發(fā)中心B細(xì)胞樣(GCB)DLBCL；(2)活化B細(xì)胞樣(ABC)DLBCL。大量研究表明lncRNA是DLBCL基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，88%的新型lncRNA的表達(dá)至少與一種蛋白質(zhì)編碼基因相關(guān)[4]。DLBCL是一種極其復(fù)雜性的侵襲性疾病，由于在臨床表現(xiàn)、mRNA表達(dá)和基因突變等方面具有高度異質(zhì)性的原因，Verma等[5]人通過對116例DLBCL組織和30例DLBCL細(xì)胞系的RNA測序(RNA-seq)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2 632個具有差異性的lncRNA，其中大約一半僅在DLBCL組織或細(xì)胞系中表達(dá)，且小部分病例中發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性lncRNA；而這些差異lncRNA中有465個新型lncRNA可以用來區(qū)分ABC和GCB 型DLBCL。Zhou等[6]通過收集GEO數(shù)據(jù)庫中ABC-DLBCL及GCB-DLBCL的測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)156個具有特異性的差異lncRNA，與Verma等[5]人所發(fā)現(xiàn)的lncRNA沒有任何重疊，再次證明DLBCL的高度分子異質(zhì)性，他們在這156個亞型特異性lncRNA中發(fā)現(xiàn)有17個lncRNA可以區(qū)分ABC和GCB型DLBCL，并稱其為subsigLnc-17，其特異性和敏感性約為90%。除了對DLBCL的上述亞型的分類研究以外，另一些基于此分類的研究報道DLBCL基因突變表達(dá)譜的文獻(xiàn)比比皆是，旨在尋找DLBCL發(fā)生發(fā)展的初始動力。GCB-DLBCL大約30%～40%存在t(14;18)易位，30%存在c-rel擴(kuò)增，20%存在組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2的突變，并且10%存在PTEN的缺失；相反ABC-DLBCL的特征在于NF-κB信號通路的活化，從而促進(jìn)細(xì)胞的存活及增殖，抑制細(xì)胞凋亡，因此更具侵襲性及較差的臨床預(yù)后；而抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2(BCL2)在GCB-DLBCL與ABC-DLBCL中均過表達(dá)[7- 8]。為了進(jìn)一步明確lncRNA與DLBCL初始動力之間的關(guān)系，Verma等[5]人篩選出位于基因反復(fù)擴(kuò)增區(qū)域并且同時過表達(dá)lncRNA，更深入地探討其與轉(zhuǎn)錄抑制因子BCL6和EZH2之間的共表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)323個和431個lncRNA分別與BCL6和EZH2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其中>40%的lncRNA是由EZH2或BCL6誘導(dǎo)的，認(rèn)為其中一些lncRNA可能是BCL6或EZH2的靶基因。以上研究表明lncRNA是DLBCL發(fā)生的初始動力中至關(guān)重要的一部分，在DLBCL的發(fā)病機(jī)制中起潛在作用。Peng等[9]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA LUNAR1在DLBCL細(xì)胞系與組織中過表達(dá)，通過qRT-PCR和Western blot等實驗觀察到在沉默LUNAR1的表達(dá)后，轉(zhuǎn)錄因子E2F1和細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)表達(dá)下調(diào)(E2F1在多種癌癥中呈現(xiàn)過表達(dá)模式，其高水平促進(jìn)癌癥進(jìn)程；cyclin D1是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要蛋白之一，在許多癌癥中過表達(dá)，通過結(jié)合并激活CDK4 / 6，進(jìn)而磷酸化腫瘤抑制蛋白(Rb)，使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期)；相反p21的表達(dá)增加(p21在多種癌癥中表達(dá)不足或缺失)，從而抑制細(xì)胞增殖，此項研究表明E2F1，cyclin D1和p21可能是LUNAR1的功能靶點。與此同時，他們還發(fā)現(xiàn)lncRNA HULC和lncRNA PEG10在DLBCL細(xì)胞中過表達(dá)，而基因間lncRNA- p21(lincRNA-p21)在DLBCL組中低表達(dá)，功能試驗發(fā)現(xiàn)HULC亦可通過cyclin D1和BCL2影響DLBCL細(xì)胞的增殖與凋亡，而PEG10的過表達(dá)與治療效果及預(yù)后呈負(fù)相關(guān)；在上調(diào)lincRNA-p21的表達(dá)后，明顯抑制DLBCL細(xì)胞的增殖，且與B癥狀(持續(xù)三天體溫>38 ℃，盜汗或者6個月內(nèi)不明原因的體重下降>10%)、國際預(yù)后指數(shù)(IPI)評分顯著相關(guān)[10-12]。他們指出lncRNA LUNAR1、HULC、PEG10及l(fā)incRNA-p21有望成為DLBCL的腫瘤標(biāo)志物。

3 LncRNA與DLBCL的耐藥性

在治療上，阿霉素是DLBCL的有效藥物之一，當(dāng)癌細(xì)胞暴露于阿霉素時，可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，刺激細(xì)胞形態(tài)變化和耐藥性，進(jìn)一步增強(qiáng)侵襲能力。蛋白LC3及p62是檢測自噬的常用標(biāo)志物，而p62的表達(dá)水平與自噬呈負(fù)相關(guān)，而自噬的激活可以抑制EMT的發(fā)生[13]。Li及其同事發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT-1在DLBCL細(xì)胞系中過表達(dá)，下調(diào)MALAT-1能抑制DLBCL細(xì)胞的增殖和遷移侵襲，使細(xì)胞在G0/G1期阻滯；為了進(jìn)一步探討MALAT-1在DLBCL化學(xué)敏感性中的作用，觀察到在下調(diào)MALAT-1后LC3-II/LC3-I蛋白表達(dá)升高，p62蛋白表達(dá)降低，表明下調(diào)MALAT-1后可激活自噬，抑制阿霉素誘導(dǎo)的EMT，從而降低對阿霉素的耐藥性，類似的結(jié)果在裸鼠體內(nèi)也得到證實[14]，為后續(xù)DLBCL避免耐藥的相關(guān)研究提供新方向。

4 LncRNA與DLBCL的預(yù)后

IPI是以臨床特征為基礎(chǔ)，包括年齡(>60歲為1分)、乳酸脫氫酶水平(LDH，>正常為1分)、美國東部腫瘤協(xié)作組ECOG的體能狀況評分(2/3/4級為1分)、Ann-Arbor分期(III/IV為1分)、淋巴結(jié)外病變受侵?jǐn)?shù)目或侵犯重要臟器(≥2個部位為1分)，上述五項IPI指標(biāo)評分總和：0～1分劃分為低危組，2分劃分為中低危組，3分劃分為中高危組，4～5分劃分為高危組，它是鑒別DLBCL高?；颊吆蛡€體化治療的最有力指標(biāo)[8]。然而，IPI并沒有考慮DLBCL患者的分子異質(zhì)性因素，即使IPI變量相同或相似的患者，他們的生存預(yù)后間差異有顯著性。Yan等[15]發(fā)現(xiàn)DLBCL組織與細(xì)胞系中的lncRNA HOTAIR過表達(dá)，且HOTAIR的表達(dá)水平與較高的IPI評分相關(guān)， HOTAIR的表達(dá)下調(diào)能使細(xì)胞停滯在G2/M期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，建議HOTAIR可用作預(yù)后指標(biāo)。另一項研究通過提取GEO數(shù)據(jù)庫中微陣列數(shù)據(jù)集，分析了1 043名DLBCL患者的lncRNA表達(dá)譜，從高危組和低危組患者中發(fā)現(xiàn)6個lncRNA(SACS-AS1，MME-AS1，CSMD2-AS1，RP11-360F5.1，RP11-25K19.1，CTC-467M3.1)存在顯著差異，并將這6個lncRNA組合到基于6-lncRNA的形式命名，通過使用單變量Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)6-lncRNA與DLBCL患者的總生存(OS)顯著相關(guān)，且6-lncRNA可以預(yù)測與IPI變化相同或相近患者的生存情況，提示6-lncRNA有望成為輔助IPI在分子水平上的預(yù)后指標(biāo)[16]。由于DLBCL患者采用目前的標(biāo)準(zhǔn)治療利妥昔單抗-環(huán)磷酰胺-阿霉素-長春新堿-潑尼松龍免疫化療方案(R-CHOP)，CHOP治療或針對基因突變的靶向治療，其中50%的患者出現(xiàn)耐藥，甚至疾病復(fù)發(fā)，約三分之一的患者最終死于疾病，而上述研究報道的這些lncRNA可以為深入研究DLBCL的發(fā)病分子機(jī)制提供新思路，同時為DLBCL診斷、治療及預(yù)后提供新的方向。見表1。

表1 LncRNA在DLBCL中的研究總覽

5 展 望

自2011年第一次報道了全基因組lncRNA表達(dá)譜以來，目前基因注釋在人類基因組中存在15 000至60 000個lncRNA，大約70%的lncRNA在物種間保守性很差，這就要求研究時要使用原代細(xì)胞，人源化動物或靈長類動物模型，有助于更深入的了解其在體內(nèi)功能及其與其他分子之間的相互作用。而GWAS的研究揭示了染色體區(qū)域內(nèi)被稱為“基因沙漠”的SNPs，可能與lncRNA的功能有關(guān)，最近研究顯示26%疾病相關(guān)的SNPs(n=11,194)與lncRNA相關(guān)聯(lián)的，而最明顯的淋巴瘤相關(guān)SNP位于8q24的PVT1基因座上[17]。同時，大量證據(jù)表明lncRNA參與淋巴瘤的形成及淋巴瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。它們在細(xì)胞中的高度特異性表達(dá)模式使它們有望成為潛在的新型腫瘤標(biāo)志物。

在過去的十年中，研究lncRNA的技術(shù)取得了很大的進(jìn)展。如采用CRISPR-Cas9或反義寡核苷酸(ASO)技術(shù)來實現(xiàn)共轉(zhuǎn)染敲低，應(yīng)優(yōu)于常規(guī)RNAi方法；可以使用常規(guī)蛋白質(zhì)-免疫沉淀(IP)或新穎的lncRNA-IP技術(shù)，如RNA純化染色質(zhì)分離技術(shù)-CHIRP來研究LncRNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。最后，RNA-熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)已經(jīng)開發(fā)出來可視化活細(xì)胞中的單個lncRNA分子[18]。此外，lncRNA數(shù)據(jù)庫不斷增長，通過評估lncRNA與已知蛋白質(zhì)的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)來確保lncRNA整合到系統(tǒng)生物學(xué)中?？傊?，lncRNA作為DLBCL發(fā)生發(fā)展的主要參與者正在被迅速挖掘。一些lncRNA顯示出作為治療靶標(biāo)的潛力，特別是那些積極參與化療效果介導(dǎo)的靶分子，努力開發(fā)可以特異性破壞lncRNA與蛋白質(zhì)相互作用的小分子抑制劑。隨著基于反義寡核苷酸的療法逐漸走向臨床，特異性靶向lncRNA治療將會是一種很有前景的新方向。