郭金云，王玉偉，孫偉民，潘瑩，姜匯涓

肺癌是臨床上常見的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率，近年來呈上升趨勢，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌的80%～85%，嚴(yán)重危害著人們的身體健康[1]。對肺癌患者來說，早期診斷比較困難，一旦確診已經(jīng)處于晚期。故靈敏度和特異度較高的診斷標(biāo)志物對診斷肺癌至關(guān)重要。miRNA是一種小分子RNA，屬于內(nèi)源性的非編碼單鏈，大量實驗表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中，發(fā)揮著重要作用，參與細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移以及侵襲等，起著癌基因以及抑癌基因的效果[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織以及癌旁組織中miRNA-126表達(dá)異常，miRNA在肺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染后，明顯抑制了細(xì)胞的增殖能力。因此，研究其相關(guān)作用機(jī)制，對肺癌患者的早期診斷、早期治療都有著重要意義?，F(xiàn)探討miRNA-126對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞功能的影響及相關(guān)機(jī)制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細(xì)胞：非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞購于武漢博士德生物工程有限公司，miRNA-126引物購于Invitrogen公司。(2)主要試劑：羊抗鼠EGFR、AKT、mTOR抗體(武漢博士德生物工程有限公司提供)；DMSO溶液、PBS緩沖液、胰蛋白酶(均由Selleck公司提供)，MTT試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供)。(3)儀器設(shè)備：DMi8倒置熒光顯微鏡(德國徠卡)、酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器公司)、離心機(jī)、流式細(xì)胞儀(均購自美國Invitrogen公司)。

1.2 實驗方法 2015年3—5月在遼寧省葫蘆島市中心醫(yī)院實驗室進(jìn)行實驗。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)： 將凍存的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞取出后，快速地采用40℃的溫度火浴，迅速搖晃均勻至融化，加入2 ml的培養(yǎng)基(10%PBS，10%～15%胎牛血清56 ml，1% 雙抗(青鏈霉素)5.56 ml，RPMI-1640培養(yǎng)基500 ml)，1 000 r/min 離心5 min棄上清液，使用完全培養(yǎng)液重懸，之后進(jìn)行傳代至培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基加至5 ml，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(濕度飽和95%，溫度37℃，CO2濃度5%)，第2天換液，當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合率達(dá)到80%～90%進(jìn)行傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染： 分組依據(jù)是轉(zhuǎn)染不同類型的質(zhì)粒，分為空白對照組和miRNA-126轉(zhuǎn)染組?？瞻讓φ战M加入PBS溶液1 μl和DMSO 1 μl。miRNA-126轉(zhuǎn)染組操作：培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合率近75%時，胰酶消化，新鮮培養(yǎng)基終止消化后，細(xì)胞計數(shù)法測量消化后培養(yǎng)瓶中細(xì)胞密度后，每六孔板中種植約4×105個細(xì)胞，加新鮮培養(yǎng)基至3 ml；37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育至細(xì)胞融合率近40%～80%；取質(zhì)粒DNA 1.5 μg溶于不含血清及雙抗的培養(yǎng)基100 μl中，混勻后離心至EP管底；再加入PolyFect Reagent 12 μl至EP管中，上下顛倒5次，混勻；室溫靜置5～10 min，促進(jìn)轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成；吸去六孔板中的培養(yǎng)基，加入新鮮完全培養(yǎng)基3 ml，完全培養(yǎng)基(含血清及雙抗)600 μl加入含轉(zhuǎn)染復(fù)合體的EP管中，上下顛倒2次，再加至六孔板中，水平搖晃促使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布；培養(yǎng)24h后常規(guī)換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后倒置熒光顯微鏡下觀察GFP類的熒光亮度，收集細(xì)胞提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率鑒定。采用流式細(xì)胞儀得出轉(zhuǎn)染效率最高的質(zhì)粒組及空載組稀釋液1 ml，接種于10 mm2培養(yǎng)皿中，每孔加入嘌呤霉素(100 μg/ml)40 μl，常規(guī)培養(yǎng)3 d后棄培養(yǎng)液，將經(jīng)過篩選的剩下的細(xì)胞消化并稀釋后接種到24孔板中，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的miRNA-126組。

1.2.3 RT-PCR檢測非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中miRNA-126基因的表達(dá)： 采用熒光定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照定量PCR儀的操作說明書進(jìn)行。首先加入稀釋10倍的PCR緩沖液2.5 μl，然后加入MgCl2溶液1.5 μl以及上游引物和下游引物0.5 μl，最后加水配成混合溶液總體積為25 μl。將混合溶液25 μl放置在94℃、55℃，72℃環(huán)境中各1 min，3 min一個循環(huán)，連續(xù)進(jìn)行30個循環(huán)，72℃環(huán)境中反應(yīng)延長5 min，重復(fù)最少3次。觀察時間定位24、48和72 h，采用2-△△Ct方法計算miRNA-126基因的表達(dá)水平。

1.2.4 MTT比色法檢測非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖能力： 將進(jìn)行培養(yǎng)后的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，然后接種于96孔的培養(yǎng)板中，在每一個孔均加入細(xì)胞懸液90 μl，觀察時間定位24 h、48 h和72 h，每一個細(xì)胞組分別設(shè)置2個復(fù)孔，空白對照組孔中加不含細(xì)胞的培養(yǎng)基。參照組細(xì)胞在每孔中加入培養(yǎng)液10 μl，然后按照3個不同時間進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。待所有細(xì)胞組培養(yǎng)到相應(yīng)的時間后，在每孔中加入MTT 20 μl繼續(xù)孵育4 h，將孔上的上清液仔細(xì)吸取，然后在孔中加入DMSO 150 μl，振蕩10 s，采用酶標(biāo)儀測定波長為570 mm的細(xì)胞組OD值，按照腫瘤細(xì)胞增殖率計算公式：增殖率=(細(xì)胞組OD值/參照值-1)×100%，對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖率進(jìn)行計算。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡： 將2組細(xì)胞傳代到2孔板中，置于溫度為37℃，濃度為5%二氧化碳的飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)24、48和72 h，加入濃度為0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，用離心機(jī)以2 000 r/min 速度離心5 min后收取細(xì)胞，然后使用PBS緩沖液洗滌3 min，重復(fù)洗滌2次，再次用離心后收集細(xì)胞，加入1MlPI染液，在避光常溫環(huán)境中放置1 h后，然后用特異熒光標(biāo)記后，在鞘液包裹下高速流動，流動期間會發(fā)射出光子，嚴(yán)格按照流式細(xì)胞儀檢測，利用發(fā)光信號測量儀檢測光子數(shù)值，到達(dá)檢測細(xì)胞凋亡的目的。

1.2.6 Transwell檢測非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲能力： 將非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h之后，使用Transwell試劑盒觀察細(xì)胞侵襲能力。每組選3個復(fù)孔，先用胰酶消化細(xì)胞，之后使用PBS緩沖液清洗1～2次，用10 g/L的BSA重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整至1×105個/ml，取細(xì)胞懸液150 μl加入到Transwell小室中，培養(yǎng)24 h，之后乙醇固定5 min，使用結(jié)晶紫溶液染色30 min，在倒置顯微鏡下觀察計數(shù)穿膜細(xì)胞。

1.2.7 倒置顯微鏡觀察非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移能力： 將非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞接種到18孔板中，將細(xì)胞增長到90%時，使用100 μl的槍頭，垂直劃出3條直線。之后經(jīng)過PBS緩沖液進(jìn)行清洗2～3次，分別加入0.5%的血清培養(yǎng)基，觀察24 h之后，使用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的遷移變化。

1.2.8 倒置顯微鏡觀察非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞形態(tài)： 將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞傳代到6孔板中，加入25%的胰蛋白酶，消化5 min后，用離心機(jī)以2 000 r/min的速度離心5 min后取上清液，用37℃的PBS緩沖液洗滌3 min，重復(fù)2次后，再次用離心機(jī)以2 000 r/min的速度離心5 min后取上清液，接著加入濃度為95%的4℃乙醇，放置15 min，用離心機(jī)以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速分離，去除上清液，PBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至為(0.5～2.0)×106/ml，去除細(xì)胞懸液后加入2 μl的Hoechst33258染液進(jìn)行染色10 min，最后置于載玻片上，加上蓋玻片，采用倒置顯微鏡對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.2.9 Western Blot檢測非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中相關(guān)表皮生長因子受體(EGFR)、AKT、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表達(dá)： 將采集到的細(xì)胞，使用PBS緩沖液清洗3遍以上，分離緩沖液，加入IP細(xì)胞裂解液，進(jìn)行裂解35 min，將雙蒸水浸泡過的細(xì)胞置于EP管中保存，溫度為5℃，使用離心機(jī)1 000 r/min速度離心20 min，分離上層血清，提取血漿，在-80℃環(huán)境中保存、待用。通過SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液15 min；100 V，電泳10 min，結(jié)束之后，將電轉(zhuǎn)膜浸泡在10%牛奶中，在37℃環(huán)境下的搖床上封閉1.5 h；與一抗結(jié)合，加入TBST稀釋按(1∶1 000)稀釋一抗，在4℃的環(huán)境下孵育過夜保存；第2天用TBST緩沖液清洗，與二抗結(jié)合在室溫下孵育1 h，再次用TBST緩沖液清洗反復(fù)清洗。最后將其僅在底物溶液中進(jìn)行顯色，采用BCA法測定蛋白濃度，嚴(yán)格按照BCA蛋白定量試劑盒操作說明書進(jìn)行，分析灰度值，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值=目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-126相對表達(dá)量比較 miRNA-126轉(zhuǎn)染組miRNA-126水平顯著高于空白對照組 (P<0.01)；空白對照組24 h、48 h、72 h的miRNA-126的相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；miRNA-126轉(zhuǎn)染組72 h的miRNA-126相對表達(dá)量顯著高于48 h和24 h，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

2.2 細(xì)胞增殖率和凋亡率比較 miRNA-126轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率顯著低于空白對照組，凋亡率顯著高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；miRNA-126轉(zhuǎn)染組72 h的細(xì)胞增殖率顯著低于48 h和24 h，miRNA-126轉(zhuǎn)染組72 h的細(xì)胞凋亡率顯著高于48 h和24 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表1 2組各時點miRNA-126相對表達(dá)量的比較

2.3 細(xì)胞侵襲、遷移能力比較 miRNA-126轉(zhuǎn)染組劃痕寬度寬于空白對照組，侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1(插頁Ⅱ)。經(jīng)過miRNA-126刺激后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體外遷移能力發(fā)生變化，遷移的細(xì)胞個數(shù)顯著減少，劃痕面積減少，見圖2(插頁Ⅱ)。經(jīng)過miRNA-126刺激后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體外侵襲能力發(fā)生變化，侵襲的細(xì)胞個數(shù)顯著減少。說明，miRNA-126可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲和遷移。見表3。

表3 2組細(xì)胞侵襲、遷移能力的比較

2.4 EGFR、AKT、mTOR表達(dá)的比較 miRNA-126轉(zhuǎn)染組EGFR、AKT、mTOR表達(dá)量顯著低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

3 討 論

肺癌的主要類型是非小細(xì)胞肺癌，其特點是在發(fā)病早期診斷率較低，一旦發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者已經(jīng)處于Ⅲ～Ⅳ期，導(dǎo)致患者病死率極高[4-6]，研究顯示，肺癌發(fā)病的機(jī)制尚未明確，但發(fā)病原因很多[7]。在治療早期肺癌最有效的方案是做到早發(fā)現(xiàn)、早治療，同時還可以提高患者的存活時間，但是就我國治療肺癌的情況來看，費(fèi)用較高、難度大、治療的時間較長，操作也復(fù)雜[8-10]。非小細(xì)胞肺癌診斷金標(biāo)準(zhǔn)是對惡性細(xì)胞進(jìn)行病理診斷，主要采取侵入性診斷方式，包括支氣管鏡、肺穿刺以及開胸手術(shù)等[11]。對于早期階段的肺癌患者主要采取胸部X線和CT掃描，但是檢出率較低，輻射對患者的危害也較大，通過痰細(xì)胞學(xué)檢測和灌洗支氣管肺泡篩查非小細(xì)胞肺癌，并不是十分有效[12]。血清標(biāo)志物檢測的敏感度和特異度不太高，但是miRNA對于早期的非小細(xì)胞肺癌診斷帶來了希望。

表4 2組EGFR、AKT、mTOR的表達(dá)比較

微小核糖核酸(miRNA)由眾多的小RNA組成，主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的增長、增殖和凋亡，促進(jìn)從細(xì)胞到組織再到器官的轉(zhuǎn)變和形成，以及對人身體的生長發(fā)育起到重要的作用[13]。隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，大量專家學(xué)者發(fā)現(xiàn)miRNA不僅在人體生理過程中發(fā)揮作用，而且在眾多疾病的發(fā)展中也起到了重要作用，例如癌癥的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移都與miRNA有著緊密的聯(lián)系。大量研究顯示[14-15]，肺癌腫瘤的分化、轉(zhuǎn)移、侵襲與miRNA的異常表達(dá)有密切聯(lián)系，比如miRNA21在肺癌患者體內(nèi)顯示高表達(dá)，并且與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移和腫瘤的發(fā)展有關(guān)；miRNA141表達(dá)異常會對肺癌的癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。

miRNA-126主要存在于EGFL7基因的啟動內(nèi)含子中，其高甲基化會影響miRNA-126的表達(dá)水平，但是過表達(dá)的miRNA-126或者對ADAM9抑制表達(dá)，都會下調(diào)EGFR/AKT信號，影響活化[16]。從而達(dá)到抑制癌細(xì)胞體外遷移的作用?，F(xiàn)在臨床上，對于miRNA-126在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制相關(guān)研究少，數(shù)據(jù)顯示[17-18]，miRNA-126對SLC7A5進(jìn)行靶向作用，對H69細(xì)胞G1期具有延遲的效果，起到抑制癌細(xì)胞的作用；miRNA-126對Crk蛋白的水平表達(dá)有介導(dǎo)作用，

表2 2組各時間段細(xì)胞增殖率及凋亡率的比較%)

對肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移起到抑制效果。有學(xué)者認(rèn)為[19]，miRNA-126通過影響VEGF水平表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖。本結(jié)果顯示，通過轉(zhuǎn)染miRNA-126，在非小細(xì)胞肺癌中顯示表達(dá)過量，影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等，并且起到了顯著的抑制效果。

非小細(xì)胞肺癌的浸潤及轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的、多步驟的、多個相關(guān)基因共同參與的過程。表皮生長因子(EGFR)是一種與細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)有關(guān)的受體，在惡性腫瘤細(xì)胞中，EGFR發(fā)揮著重要的作用，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡，有助于新生血管的形成，細(xì)胞運(yùn)動能力得到顯著提高[20-22]。如果EGFR表達(dá)異常或者發(fā)生突變，都會導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。EGFR作為一種跨膜糖蛋白，其具有配體介導(dǎo)酪氨酸激酶活性的多功能作用。EGF與EFGR高親和力結(jié)合一起作用，EGFR被磷酸化會發(fā)生級聯(lián)放大反應(yīng)，下游相關(guān)的信號通路會被激活，其中包括和磷脂酰肌醇有關(guān)的PI3K/Akt通路，在細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中直接參與，在細(xì)胞的增殖和分化中具有重要意義。AKT是一種臨床上較為常見的絲/蘇氨酸蛋白激酶，P-AKT則是磷酸化的AKT，P-AKT具有一定的生物學(xué)活性，因為其蛋白產(chǎn)物與蛋白激酶A、蛋白激酶C具有高度的同源性，所以臨床上又稱之為蛋白激酶B(PKB)[23-25]。P-AKT能夠通過對人體各種下游分子產(chǎn)生作用，從而調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而對腫瘤的生物學(xué)進(jìn)展產(chǎn)生影響[26]。EGFR主要的下游信號有PI3K/AKT、STAT3等，研究顯示，EGFR在肺癌中過表達(dá)的發(fā)生率在37%～60%，與患者的分期有關(guān)，分期越晚，EGFR表達(dá)越高，說明其與肺癌的發(fā)展有緊密聯(lián)系[27]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)屬于Akt的下游信號因子，在調(diào)控PI3K和蛋白激酶B(PI3K/Akt)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用[28]。本結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌經(jīng)過miRNA-126轉(zhuǎn)染，EGFR、AKT、mTOR的表達(dá)水平顯著降低。EGFR、AKT、mTOR途徑在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲以及遷移過程中，發(fā)揮著重要的功能。分析可能原因：EGFR表達(dá)上調(diào)且發(fā)生激活就會形成pEGFR，會造成mTOR被激活。mTOR是PI3K/Akt信號通路的直接作用底物，起到的主要作用是對細(xì)胞營養(yǎng)能力以及氧化有關(guān)信息進(jìn)行整合，調(diào)控細(xì)胞生長，是蛋白合成的關(guān)鍵性調(diào)控點。在細(xì)胞組織中EGFR表達(dá)上調(diào)，p-Akt也隨之上調(diào)，通路活性升高；當(dāng)EGFR表達(dá)下調(diào)時，其通路的活性隨之降低。EGFR是Akt下游的作用底物，當(dāng)mTOR活性發(fā)生變化，Akt也隨之改變[29]。在一定的環(huán)境下，通過激活EGFR/AKT/mTOR信號通路對細(xì)胞的生長和抑制起到調(diào)控的作用，成為分子變阻器，促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)的相互作用，促進(jìn)產(chǎn)生活性氧，最終的結(jié)果是影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞功能[30]。

綜上所述，轉(zhuǎn)染的miRNA-126通過調(diào)控EGFR、AKT、mTOR表達(dá)，抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲以及遷移能力，為非小細(xì)胞肺癌患者臨床治療提供理論依據(jù)。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

郭金云、王玉偉：設(shè)計研究方案，論文撰寫；孫偉民、潘瑩、姜匯涓：實施研究過程，資料搜集整理