陳鵬，包希艷，康濤濤，董戰(zhàn)旗，朱艷，潘敏慧，魯成

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家蠶IAP互作蛋白的篩選、鑒定及其對BmNPV增殖的影響

陳鵬1,2，包希艷1，康濤濤1，董戰(zhàn)旗1，朱艷1，潘敏慧1,2，魯成1,2

（1西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室，重慶 400715；2西南大學(xué)農(nóng)業(yè)部蠶桑生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，重慶 400715）

【目的】細胞凋亡作為昆蟲免疫應(yīng)答的重要組成部分，在病毒與宿主相互作用的過程中扮演著重要角色，以細胞凋亡相關(guān)基因為研究對象對闡明其在病毒感染過程中的作用具有重要的參考價值。本研究旨在篩選家蠶凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，BmIAP）的相互作用蛋白，并驗證其在家蠶核型多角體病毒（nucleopolyhedrovirus, BmNPV）侵染過程中與的相互調(diào)控關(guān)系及在BmNPV增殖過程中的作用，為探明宿主與BmNPV相互作用的分子機制提供理論依據(jù)?！痉椒ā坷妹庖吖渤恋砑夹g(shù)篩選在BmNPV侵染家蠶細胞過程中與BmIAP相互作用的蛋白，對獲得的特異性差異條帶進行LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜分析，根據(jù)蛋白分子量大小并利用生物信息學(xué)方法對獲得的蛋白進行鑒定，確定候選基因；通過分子克隆技術(shù)對候選基因進行克隆，利用SMART在線工具及BioEdit分別對候選基因的結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測及多序列比對分析；通過免疫熒光試驗驗證BmIAP和候選蛋白的細胞共定位情況，并進一步利用免疫共沉淀驗證它們的相互作用；分別通過真核表達和基于CRISPR/Cas9的基因編輯系統(tǒng)對候選基因進行過表達和敲除，利用qRT-PCR技術(shù)檢測相應(yīng)基因的表達情況，以確定和在BmNPV侵染過程中的調(diào)控關(guān)系；同樣，在過表達和敲除后檢測桿狀病毒的表達量，以確定對BmNPV增殖的影響?！窘Y(jié)果】通過免疫共沉淀獲得7個可能與BmIAP相互作用的宿主蛋白和1個BmNPV蛋白，進一步分析確定1個與凋亡相關(guān)的候選基因；的開放閱讀框為1 473 bp，編碼490個氨基酸，預(yù)測的蛋白分子量約為56 kD，含3個TRP結(jié)構(gòu)域和1個PP2Ac結(jié)構(gòu)域，在昆蟲間具有較高的保守性；免疫熒光檢測證明BmIAP和BmPP5共定位于細胞質(zhì)中，免疫共沉淀結(jié)果表明兩者可以相互作用；在BmNPV侵染過程中，過表達后，的表達量顯著上調(diào)，而敲除后，的表達量顯著下調(diào)，表明能夠促進的表達；同時，過表達后，顯著上調(diào)表達，而敲除后，顯著下調(diào)表達，表明同樣能夠促進的表達；過表達能夠促進BmNPV的增殖，敲除能夠抑制BmNPV的增殖，表明的表達利于BmNPV的增殖?！窘Y(jié)論】鑒定了1個能夠與BmIAP相互作用的蛋白BmPP5，且該蛋白在昆蟲中高度保守；在BmNPV侵染過程中，和能夠相互促進，且能夠促進BmNPV的復(fù)制增殖。

家蠶；凋亡抑制蛋白；互作蛋白；家蠶核型多角體病毒；BmPP5

0 引言

【研究意義】桿狀病毒是一類專門寄生于無脊椎動物的病毒，尤其是鱗翅目、雙翅目和膜翅目昆蟲。作為一種細胞內(nèi)寄生物，桿狀病毒與宿主細胞以及機體的相互作用關(guān)系決定了病毒感染、復(fù)制和致病的分子機制。細胞凋亡作為機體細胞內(nèi)的免疫直接參與病毒感染的應(yīng)答，啟動宿主細胞的凋亡機制。家蠶核型多角體病毒（nucleopolyhedrovirus，BmNPV）作為家蠶血液型膿病的病原，屬于桿狀病毒的一種，也是蠶業(yè)生產(chǎn)上危害最嚴重的病原微生物之一。對BmNPV致病機制的研究可為家蠶抗BmNPV病毒新品種的培育提供新的思路和重要理論支撐，同時，以細胞凋亡相關(guān)基因為研究對象對闡明其在桿狀病毒感染過程中的作用具有重要的參考價值?！厩叭搜芯窟M展】桿狀病毒是一類具有環(huán)狀、超螺旋、雙鏈DNA（80—180 kb）的病毒，其與宿主的相互作用機制一直是研究的熱點[1]。當(dāng)桿狀病毒侵染宿主時，宿主細胞會通過調(diào)控自身的相關(guān)基因通路來應(yīng)對病毒的入侵和增殖，如細胞凋亡[2-3]、DNA損傷應(yīng)答[4]、熱休克應(yīng)答[5-6]和miRNA通路[7-8]等。研究表明，家蠶感染BmNPV后，在不同的時間點會引起一系列信號通路的變化，如能量代謝、細胞骨架、鐵離子代謝和泛素蛋白酶體途徑等[9]。同時，病毒在進化過程中，除了自身蛋白可以相互作用以促進其增殖復(fù)制[10]，也獲得了多種逃逸機體免疫反應(yīng)的機制，如抑制宿主細胞凋亡[11-13]、挾持宿主細胞DNA損傷應(yīng)答[14-15]、關(guān)閉宿主蛋白合成[16]、阻斷宿主細胞周期[17-18]等。其中，細胞凋亡作為昆蟲免疫應(yīng)答的重要組成部分，在病毒與宿主的“斗爭”過程中起著重要作用[19]。病毒的復(fù)制嚴格依賴于宿主細胞，過早的細胞凋亡會影響病毒的增殖和持續(xù)感染，因此，細胞凋亡被宿主作為為一種重要防御策略，可以有效抑制病毒復(fù)制增殖，降低病毒的擴散速度[20-21]。然而，在病毒與宿主相互作用的過程中，細胞凋亡相關(guān)基因的具體功能及作用機制仍需要深入的研究。筆者實驗室前期研究表明，在家蠶中存在4個凋亡抑制基因（inhibitor of apoptosis，IAP）家族成員（、和）[22]，其中有研究表明具有明確的抑制細胞凋亡功能[23-24]。然而，在BmNPV侵染過程中的作用尚需進一步研究?！颈狙芯壳腥朦c】以昆蟲重要的先天免疫應(yīng)答反應(yīng)——細胞凋亡作為切入點，家蠶凋亡抑制基因作為研究對象，鑒定在BmNPV侵染家蠶細胞過程中與其相互作用的蛋白，并對獲得的蛋白功能進行驗證?！緮M解決的關(guān)鍵問題】鑒定在BmNPV侵染過程中與BmIAP相互作用的蛋白，并驗證相應(yīng)蛋白與BmIAP的調(diào)控關(guān)系及其對BmNPV增殖的影響，為抗BmNPV家蠶品種培育提供分子靶標(biāo)，并為深入闡明桿狀病毒和宿主相互作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2016—2018年在家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室（西南大學(xué)）完成。

1.1 試驗材料

家蠶卵巢細胞系BmN-SWU1[25]由家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室保存，用含10%胎牛血清的TC-100昆蟲培養(yǎng)基在27℃條件下恒溫培養(yǎng)。重組BmNPV病毒（v39Kprm-EGFP）[26]由家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室保存。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

根據(jù)目的基因序列設(shè)計相應(yīng)引物，并在上下游引物分別添加相應(yīng)的酶切位點、保護堿基和標(biāo)簽序列（表1），在GenBank中的序列號為NM_001043559.1，基因克隆步驟參考張倩等[27]的方法。用于構(gòu)建過表達和敲除質(zhì)粒的載體分別為pIZ/V5-His載體和本研究小組構(gòu)建的基于Cas9的轉(zhuǎn)基因敲除載體[28]。家蠶BmN-SWU1細胞均勻鋪到12孔板中，每孔按單轉(zhuǎn)1 μg，共轉(zhuǎn)各0.8 μg質(zhì)粒計算；質(zhì)粒和X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent（Roche）轉(zhuǎn)染試劑按1﹕3，加入100 μl無抗培養(yǎng)基，輕輕呈滴狀混勻，室溫孵育30 min；將上述轉(zhuǎn)染混合物逐滴加入細胞中，輕輕晃動混勻，置于27℃恒溫箱培養(yǎng)，培養(yǎng)6—8 h換液，按試驗需要進行后續(xù)處理。

表1 引物信息

1.3 總RNA提取和cDNA合成

家蠶BmN-SWU1細胞總RNA使用TRIzol Reagent（Invitrogen）提取，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）合成cDNA，操作按說明書進行，保存于-20℃?zhèn)溆?。按?.2方法轉(zhuǎn)染48 h，感染BmNPV 12、24、48、72 h后收集細胞。使用總RNA提取試劑盒（OMEGA），加入500 μl的TRK Lysis Buffer充分裂解細胞，后收集到1.5 mL無RNA酶的EP管中；加入75%乙醇250 μl輕輕搖勻，將上述樣品移至RNA吸附柱，室溫靜置5 min后，4℃，10 000×離心1 min；用RNA Wash Buffer I、II，各清洗兩次；用 60℃的35 μL DEPC水溶解RNA；采用紫外分光光度計檢測洗脫下來RNA，合格后-80℃保存。

按上述方法提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）反轉(zhuǎn)錄cDNA。在4℃配制去除基因組DNA的混合液，將上述混合液加入總RNA中，42℃，2 min；4℃配制反轉(zhuǎn)錄混合液，將上述混合液加入已去除基因組的RNA中，37℃，1.5 min；85℃，5 s；12℃保存。將反轉(zhuǎn)合成的cDNA稀釋后用的引物做PCR擴增，合格cDNA貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫熒光檢測

取待檢測的細胞在室溫用PBS洗2次；4%多聚甲醛室溫固定15 min；用PBST在室溫漂洗5次，每次6 min；0.1% Triton 100室溫孵育10 min；用PBST在室溫漂洗5次，每次6 min；封閉液（10%羊血清加3% BSA，用PBS配制）封閉1 h，37℃；37℃一抗（HA抗體或Flag抗體，1﹕500，sigma）孵育1 h；用PBST在室溫漂洗5次，每次6 min；在37℃用不同熒光標(biāo)記的二抗（1﹕1 000，碧云天）孵育1 h；室溫DAPI（碧云天）染細胞核10 min；用PBST在室溫漂洗5次，每次6 min；將鋪滿細胞的爬片封到載玻片上，使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察拍照。

1.5 免疫共沉淀與質(zhì)譜鑒定

取轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒48 h后的細胞并倒掉培養(yǎng)基，PBS洗兩遍；加入1 mL IP裂解液（IP裂解液﹕PMSF=100﹕1）冰浴輕搖30 min；將裂解下的細胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，液氮反復(fù)凍融2—3次；10 000 ×，4℃，離心30 min，取上清50 μL轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，煮10 min，作為總蛋白；重懸磁珠，取60 μL磁珠放到磁力架上吸去廢液，以400 μL IP裂解液洗一遍；加400 μL IP裂解液和3 μL抗體，翻轉(zhuǎn)搖床上常溫孵育40—50 min；將上步中孵育了抗體的磁珠放至磁力架上，棄液；將剩余裂解液與上步中的磁珠混勻，翻轉(zhuǎn)搖床上室溫孵育2 h；將1.5 mL的離心管放至磁力架上，吸掉孵育液；用PBS洗3遍，每遍500 μL；加入60 μL的IP裂解液和15 μL的5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，煮10 min；將離心管放到磁力架上，將樣品吸出，進行SDS-PAGE分析；電泳結(jié)束后用硝酸銀進行凝膠染色，對銀染后呈現(xiàn)的差異條帶進行切膠回收，通過LC-MS/MS分析，得到相應(yīng)蛋白質(zhì)信息，通過檢索家蠶蛋白數(shù)據(jù)庫（http://www.silkdb.org/ silkdb/doc/download.html）和NCBI中的BmNPV蛋白數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/?term= BmNPV）對蛋白進行鑒定（此部分委托深圳華大完成）。

1.6 Western blot和銀染分析

制備12%的SDS-PAGE凝膠，上樣并進行電泳；200 mA轉(zhuǎn)膜50 min；把PVDF膜放入封閉液中，室溫搖床孵育3 h；將PVDF膜從封閉液中取出放入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜；在1×TBST緩沖液中清洗5次（室溫），每次10 min；將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育2 h；將配好的ECL顯色液均勻的滴在PVDF膜上，避光顯色約5 min；在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光成像。

1.7 熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測

qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃，4 min；95℃，15 s，60℃，31 s，40個循環(huán)；95℃，15 s；60℃，20 s；95℃，15 s。所用引物見表1，試劑為iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix（Bio-Rad），以家蠶真核翻譯起始因子4A（探針號：sw22934）為內(nèi)參，相對定量PCR的數(shù)據(jù)處理用2-ΔCT法。

2 結(jié)果

2.1 BmNPV侵染過程中BmIAP相互作用蛋白篩查

為檢測在BmNPV侵染家蠶細胞過程中與BmIAP相互作用的蛋白，通過免疫共沉淀技術(shù)獲得了BmN- SWU1細胞中與BmIAP的免疫共沉淀復(fù)合物。將收集的免疫共沉淀蛋白復(fù)合物進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)硝酸銀染色后分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，BmIAP-Flag融合蛋白的免疫共沉淀結(jié)果中有1條明顯的特異性條帶，大小在40—50 kD（圖1）。特異性差異條帶經(jīng)LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜分析，將多肽序列與SilkDB和BmNPV蛋白數(shù)據(jù)庫比對，共鑒定到45個蛋白。根據(jù)蛋白分子量大小對鑒定到的蛋白進行篩選，獲得7個可能與BmIAP相互作用的宿主蛋白，同時有1個BmNPV蛋白ORF76（表2）。進一步對獲得的蛋白功能進行分析，發(fā)現(xiàn)（編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，Ser/thr protein phosphatase 5，PP5）的同源基因具有凋亡相關(guān)的功能[29-30]，因此在本研究中將其作為主要研究對象，并命名為BmPP5（ser/thr protein phosphatase 5）。

表2 LC-MS/MS鑒定與BmIAP相互作用的蛋白

Marker：蛋白分子量預(yù)染Marker Protein molecular weight marker；Input：BmNPV感染BmN-SWU1細胞總蛋白input cell lysates；IgG：陰性血清IgG的免疫共沉淀結(jié)果IP with control mouse IgG；Flag：Flag抗體的免疫共沉淀結(jié)果；黑色箭頭指示差異條帶IP with Flag antibody; Black arrow indicates the specific band

2.2 Bmpp5克隆及序列特征分析

成功克隆了的CDS序列，其中開放閱讀框（open reading frame，ORF）為1 473 bp，編碼490個氨基酸，預(yù)測的蛋白分子量約為56 kD。利用SMART在線工具（http://smart.embl-heidelberg.de/）對BmPP5的結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該基因有3個Tetratricopeptide Repeat（TRP）結(jié)構(gòu)域和1個PP2Ac結(jié)構(gòu)域（圖2-A）。分別利用家蠶、斜紋夜蛾（）、埃及伊蚊（）及果蠅（）的PP5同源蛋白進行多序列比對，結(jié)果表明該基因在昆蟲中高度保守（圖2-B）。

2.3 BmIAP和BmPP5的相互作用鑒定

利用免疫熒光和免疫共沉淀進一步驗證BmIAP蛋白與其釣取到的候選互作蛋白BmPP5是否存在相互作用。構(gòu)建了（融合Flag標(biāo)簽）和（融合HA標(biāo)簽）的真核過表達載體，轉(zhuǎn)染家蠶BmN- SWU1細胞，48 h后通過免疫熒光觀察其定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)帶有Flag標(biāo)簽的BmIAP蛋白能夠與帶有HA標(biāo)簽的BmPP5蛋白共定位于細胞質(zhì)中（圖3-A），暗示它們之間可能存在相互作用。為進一步確定BmIAP和BmPP5之間的關(guān)系，將以上兩個過表達載體共轉(zhuǎn)家蠶BmN-SWU1細胞48 h后，收集細胞，用Flag標(biāo)簽抗體為誘餌，小鼠IgG抗體為對照，通過免疫共沉淀對BmIAP和BmPP5的相互作用進行驗證。結(jié)果顯示，無論是用Flag抗體還是HA抗體進行western blot檢測，均能檢測到相應(yīng)目的蛋白的表達（圖3-B），表明BmIAP和BmPP5之間存在相互作用。

2.4 Bmiap和Bmpp5在BmNPV侵染過程中的調(diào)控分析

為了分析和在BmNPV侵染過程中的調(diào)控關(guān)系，首先通過在BmN-SWU1細胞中過表達或敲除，然后利用BmNPV侵染細胞，通過qRT-PCR檢測的表達水平。結(jié)果顯示，過表達后，的表達量顯著上調(diào)（圖4-A），其中24 h時上調(diào)不顯著，推測可能是由于BmNPV不同的復(fù)制時期造成的；而敲除后，的表達量顯著下調(diào)（圖4-B），表明對具有一定的促進作用。

A：SMART預(yù)測BmPP5的結(jié)構(gòu)域 Prediction of BmPP5 domains by SMART，TPR：19—52 aa、53—86 aa、87—120 aa；PP2Ac：195—471 aa。B：BmPP5蛋白多序列比對 Multiple sequence alignment of BmPP5 protein。Bm：家蠶Bombyx mori（XP_012553114.1）；Sl：斜紋夜蛾Spodoptera litura（XP_022817467.1）；Aa：埃及伊蚊Aedes aegypti（XP_001650298.2）；Ds：果蠅Drosophila serrata（XP_020818529.1）

圖3 免疫熒光和免疫共沉淀分析BmIAP和BmPP5的相互作用

同樣，通過分別在BmN-SWU1細胞中過表達或敲除，并檢測的表達情況。結(jié)果顯示，過表達后，顯著上調(diào)表達（圖4-C），而敲除后，的顯著下調(diào)表達（圖4-D），表明同樣能夠促進的表達。

2.5 Bmpp5對BmNPV增殖的影響

為了進一步驗證在BmNPV增殖過程中的作用，分別在BmN-SWU1細胞中過表達或敲除后，利用BmNPV侵染細胞，并檢測桿狀病毒的表達水平。結(jié)果顯示，過表達后在感染24 h時能夠在一定程度上引起的下調(diào)表達，推測在BmNPV感染前期引起的宿主細胞免疫反應(yīng)可能對BmNPV增殖有一定的抑制作用，而在感染后期能夠引起的上調(diào)表達；敲除后，的表達下調(diào)（圖5），表明的表達利于BmNPV的增殖。

A：過表達Bmiap對Bmpp5的影響Effect of overexpression of Bmiap on Bmpp5；B：敲除Bmiap對Bmpp5的影響Effect of knockout of Bmiap on Bmpp5；C：過表達Bmpp5對Bmiap的影響Effect of overexpression of Bmpp5 on Bmiap；D：敲除Bmpp5對Bmiap的影響Effect of knockout of Bmpp5 on Bmiap。*P＜0.05；**P＜0.01

3 討論

細胞凋亡作為昆蟲免疫應(yīng)答的重要組成部分，可以有效抵御病毒的復(fù)制增殖，而宿主和病毒中凋亡抑制基因（）的同時存在[31-32]，暗示其可能在病毒與宿主相互作用過程中起著重要作用，同時也為研究其分子機制提供了極好的切入點。

PP5屬于蛋白磷酸酶家族成員，參與多種信號通路，如DNA損傷、細胞生長、細胞凋亡等[29-30,33-34]，其能夠使許多與細胞應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的蛋白去磷酸化，如凋亡信號調(diào)節(jié)激酶（ASK-1）[35]、DNA-PKcs[36]等。本研究證明了BmPP5能夠與BmIAP蛋白發(fā)生相互作用，并且在BmNPV侵染過程中，促進上調(diào)表達的同時，同樣能夠促進的表達，進而使細胞凋亡受到抑制。由此，筆者推測BmIAP和BmPP5的相互作用能夠促進二者的表達，但是如何相互作用并不清楚。PP5在DNA損傷修復(fù)以及下游細胞周期阻滯和細胞凋亡過程主要是通過對ATM（ataxia telangiectasia mutated）、53BP1等蛋白磷酸化修飾，參與非同源末端連接和同源重組修復(fù)。因此，BmPP5對BmIAP蛋白磷酸化修飾調(diào)控細胞凋亡通路的過程是未來研究的重點。此外，還發(fā)現(xiàn)能夠促進BmNPV的增殖，表明在BmNPV侵染過程中，和間可能存在正反饋調(diào)節(jié)作用，增強對宿主細胞的凋亡抑制作用，使BmNPV可以充分利用宿主細胞進行自身的復(fù)制增殖，這也進一步證明了細胞凋亡途徑在桿狀病毒與宿主的相互作用過程中起著重要作用。

A：過表達Bmpp5 Overexpression of Bmpp5；B：敲除Bmpp5 Knockout of Bmpp5。**P＜0.01

本研究以家蠶為研究對象，通過免疫共沉淀鑒定并篩選與其相互作用的基因，根據(jù)分子量大小共篩選得到7個家蠶基因，同時還獲得1個BmNPV的基因。BmNPV幾乎存在于所有的桿狀病毒基因組中，暗示著其功能的重要性。該基因在AcMNPV中的同源基因為，研究表明敲除的突變體將不能產(chǎn)生感染性的BV，并且可能參與了核內(nèi)微泡的形成[37]。同樣，敲除后的BmNPV bacmid也不會產(chǎn)生BV[38]，表明該基因的功能具有一定的保守性。BmNPV ORF76與BmIAP的相互作用機制及其功能的解析也將是后續(xù)研究的重點內(nèi)容。

4 結(jié)論

鑒定了與BmIAP相互作用的蛋白BmPP5，該蛋白在昆蟲中具有較高的保守性。證明了在家蠶核型多角體病毒（BmNPV）侵染過程中和能夠相互促進，同時能夠促進BmNPV的復(fù)制增殖。

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Screening and identification of proteins interacting withIAP and their effects on BmNPV proliferation

CHEN Peng1,2, BAO XiYan1, Kang TaoTao1, DONG ZhanQi1, ZHU Yan1, PAN MinHui1,2, LU Cheng1,2

(1State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400715;2Key Laboratory of Sericultural Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture, Southwest University, Chongqing 400715)

【Objective】As an important part of insect immune response, apoptosis plays an important role in the interaction between virus and host. The study of apoptosis-related genes is of great value in elucidating their roles in the process of virus infection. The objective of this study is to screen the interaction proteins ofinhibitor of apoptosis proteins (BmIAP), verify the regulatory relationships between them andin the process ofnucleopolyhedrovirus (BmNPV) infection and their roles in the proliferation of BmNPV, and to provide a theoretical basis for exploring the molecular mechanismof the interaction between host and BmNPV.【Method】The proteins interacting with BmIAP in the process ofBmNPV infection incells were screened by immunoprecipitation, and the specific differential bands were analyzed by LC-MS/MS. The obtained proteins were identified according to the molecular weight of the protein and bioinformatics method. The candidate gene was obtained by molecular cloning technique, and the domain of the candidate gene was predicted by SMART online tools and the multiple sequence alignment analysis was performed with BioEdit. Co-localization of BmIAP and candidate protein was verified by immunofluorescence assay, and their interaction was further verified by immunoprecipitation. The candidate gene was overexpressed and knocked out by eukaryotic expression and CRISPR/Cas9 gene editing system, respectively. The expression of corresponding genes was detected by qRT-PCR to determine the regulatory relationship betweenandwas detected after overexpression and knockout ofto determine the effect ofon the proliferation of BmNPV.【Result】Seven host proteins and one BmNPV protein which may interact with BmIAP were obtained by immunoprecipitation and further analysis identified a candidate geneassociated with apoptosis. The open reading frame (ORD) ofis 1 473 bp, encoding 490 amino acids. The predicted molecular weight of Bmpp5 is about 56 kD. It contains three TRP domains and one PP2Ac domain. It is highly conserved among insects. Immunofluorescence assay showed that BmIAP and BmPP5 were co-localized in cytoplasm, and the results of immunoprecipitation showed that they could interact with each other. In the process of BmNPV infection, after overexpression of, the expression ofwas significantly up-regulated, while after knockout of, the expression ofwas significantly down-regulated, suggesting thatcould promote the expression of.was significantly up-regulated after overexpression of, whilewas significantly down-regulated after knockout of, suggesting thatcould also promote the expression of. Overexpression ofcould promote the proliferation of BmNPV, and knockdown ofcould inhibit the proliferation of BmNPV, indicating that the expression ofwas conducive to the proliferation of BmNPV. 【Conclusion】a protein BmPP5, which interacts with BmIAP was identified and highly conserved in insects. In the process of BmNPV infection,andcan promote each other. It is also proved thatcan promote the replication and proliferation of BmNPV.

; inhibitor of apoptosis protein (IAP); interaction protein; BmNPV; BmPP5

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.03.016

2018-08-31；

2018-09-17

國家自然科學(xué)基金（31602009，31572466）、西南大學(xué)博士基金（SWU116066）、國家蠶桑產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-18）

陳鵬，E-mail：pjchen@swu.edu.cn。通信作者魯成，E-mail：lucheng@swu.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）