劉海洋，王偉，張仁福，熱西達(dá)·阿不都熱合曼，姚舉

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黃萎病不同發(fā)生程度棉田土壤中的真菌群落特征分析

劉海洋1，王偉1，張仁福1，熱西達(dá)·阿不都熱合曼2，姚舉1

（1新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；2新疆伊寧市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，新疆伊寧 835000）

【目的】真菌是土壤微生物系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)土壤環(huán)境變化有明顯的指示作用。本研究對(duì)黃萎病不同發(fā)生程度棉田土壤中的真菌群落特征進(jìn)行分析，旨在探明大麗輪枝菌（）入侵棉田對(duì)土壤中真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響，揭示土壤中真菌群落在棉花黃萎病發(fā)生過(guò)程中的生態(tài)作用。【方法】以阿克蘇、石河子不同發(fā)病程度棉田和庫(kù)爾勒人工接菌棉田為研究對(duì)象，從中采集6個(gè)土壤樣品：阿克蘇重病田土壤（AD）、阿克蘇對(duì)照田土壤（ACK）、石河子重病田土壤（SD）、石河子對(duì)照田土壤（SCK）、庫(kù)爾勒重病田土壤（KD）、庫(kù)爾勒對(duì)照田土壤（KCK）。采用Illumina Hiseq高通量測(cè)序技術(shù)，研究土壤中真菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)，結(jié)合冗余分析（RDA）明確真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】在97%相似度水平下，AD和SD樣品中真菌的OTU數(shù)量、Chao1和Ace豐富度指數(shù)均分別高于其對(duì)照ACK、SCK，而Simpson指數(shù)均分別低于其對(duì)照；人工接菌的KD與其對(duì)照KCK樣品之間OTU數(shù)量、Chao1和Ace豐富度指數(shù)以及Simpson指數(shù)均無(wú)顯著差異。NMDS分析表明，AD、SD土壤樣品首先表現(xiàn)為明顯的空間趨向性，之后表現(xiàn)為時(shí)間趨向性，而庫(kù)爾勒土壤樣品則首先表現(xiàn)為時(shí)間趨向性，其次是空間趨向性。群落組成方面，在門(mén)水平上，土壤中Ascomycota的豐度占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其次為Basidiomycota和Mortierellomycota，3個(gè)門(mén)在KD與KCK樣品之間以及SD與SCK樣品之間的豐度差異較小，而在AD和ACK樣品之間豐度差異較大；在屬水平上，的豐度最高，其與在不同區(qū)域重病田土壤中豐度均高于對(duì)照，而均低于對(duì)照。此外，AD樣品中、、的豐度均低于ACK，而此3個(gè)屬在SD樣品中的豐度均高于SCK樣品。組間差異顯著分析表明，庫(kù)爾勒、石河子土壤中的顯著差異標(biāo)記均主要富集于重病田中，而阿克蘇土壤中顯著差異標(biāo)記主要富集于無(wú)病田中。相關(guān)性分析表明，土壤中有機(jī)質(zhì)、全氮量與真菌的OTU數(shù)量、豐度呈顯著正相關(guān)，與Simpson指數(shù)的相關(guān)性低；pH、全磷和全鉀與Simpson指數(shù)明顯正相關(guān)，總鹽與Simpson指數(shù)明顯負(fù)相關(guān)。RDA分析表明，土壤中的真菌群落與有機(jī)質(zhì)、全氮、總鹽明顯相關(guān)?！窘Y(jié)論】自然重病棉田土壤中真菌的OTU數(shù)量、豐度均高于輕病或無(wú)病田，而真菌的多樣性低。人工接種大麗輪枝菌短期內(nèi)未對(duì)土壤中真菌的豐度、多樣性和群落結(jié)構(gòu)造成明顯影響。土壤中真菌的多樣性、豐度和組成受有機(jī)質(zhì)、全氮、含鹽量等指標(biāo)影響顯著。采樣時(shí)期對(duì)土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)同樣有明顯影響。

大麗輪枝菌；棉花黃萎??；入侵；棉田土壤；真菌群落；高通量測(cè)序

0 引言

【研究意義】真菌是土壤微生物系統(tǒng)的重要組成部分，其種群結(jié)構(gòu)的變化能夠反映土壤生態(tài)的狀態(tài)及變化趨勢(shì)[1]。真菌在土壤生態(tài)系統(tǒng)中作為分解者[2]，其分泌的酶可以降解易分解化合物，有利于植物吸收氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素[3]，在促進(jìn)土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)、形成土壤團(tuán)聚體和改良土壤結(jié)構(gòu)等方面具有重要作用[4-5]。與細(xì)菌相比，真菌能更好地降解復(fù)雜化合物[6]，對(duì)土壤環(huán)境的變化更敏感[7]，其動(dòng)態(tài)變化可作為土壤生態(tài)變化規(guī)律的指示因子[8-9]。棉花黃萎病菌（大麗輪枝菌）可在土壤中長(zhǎng)期存活，一旦入侵土壤便難以消除。作為土傳病害，棉花黃萎病的發(fā)生與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、土壤養(yǎng)分指標(biāo)等因素密切相關(guān)。對(duì)新疆棉花黃萎病不同發(fā)生程度棉田土壤中的真菌群落特征進(jìn)行分析，研究黃萎病菌入侵對(duì)棉田土壤中真菌多樣性和群落組成的影響，有助于揭示病菌侵染與土壤中真菌群落的互作關(guān)系?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】顧美英等[10]研究表明，發(fā)病棉花根際土壤中的微生物總量、真菌數(shù)量均大于健康棉株，認(rèn)為大麗輪枝菌侵染棉花能導(dǎo)致其根際土壤中的真菌數(shù)量大幅度增加；Luan等[11]報(bào)道發(fā)病棉花根際土壤中鐮孢菌屬（）、輪枝菌屬（）數(shù)量較多，而在健康棉花根際土中木霉屬（）等有益菌的數(shù)量顯著高于發(fā)病棉花。其他植物受病原菌侵染后亦有較為一致的研究結(jié)論，鄧曉等[12]研究表明香蕉枯萎病危害程度中、重度土壤中真菌種類(lèi)無(wú)明顯改變，但是數(shù)量較危害程度輕和無(wú)危害土壤卻明顯增加。植物根腐病的發(fā)生能夠引起土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的明顯改變，王玲娜等[13]研究表明，芹菜根腐病發(fā)病初期病株根區(qū)真菌的數(shù)量較健康株有所減少，而在發(fā)病中、晚期病株真菌數(shù)量均較健康株有所增加；李雪萍等[14]研究發(fā)現(xiàn)，青稞根腐病的發(fā)生會(huì)使根際土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量減少，真菌數(shù)量增多；官會(huì)林等[15]研究表明，三七根腐病的發(fā)生與土壤中厭氧細(xì)菌、真菌及放線菌數(shù)量的增加及其種群數(shù)量比例變化有密切的關(guān)聯(lián)性。葉部病害的發(fā)生同樣能夠引起土壤中真菌的富集，吳斌等[16]研究發(fā)現(xiàn)，作物地上組織發(fā)病如小麥黃花葉病毒病發(fā)病嚴(yán)重地塊的真菌數(shù)量和種類(lèi)顯著增加?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，利用平板計(jì)數(shù)等傳統(tǒng)方法分析棉花黃萎病株根際土壤中可培養(yǎng)微生物有少量研究。然而利用Illumina Hiseq高通量測(cè)序技術(shù)研究棉花黃萎病不同發(fā)生程度棉田土壤中真菌多樣性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)新疆不同區(qū)域黃萎病發(fā)生程度不同的棉田土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入分析，探明棉田黃萎病發(fā)生程度由重至無(wú)、由無(wú)至重過(guò)程中土壤真菌群落的變化特征，以期揭示土壤中的真菌群落在棉花黃萎病發(fā)生過(guò)程中的生態(tài)作用，為利用微生態(tài)調(diào)控手段防控棉花黃萎病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年在阿克蘇市（40°34′ N，81°19′ E）、庫(kù)爾勒市（41°45′ N，85°48′ E）和石河子市（44°18′ N，85°59′ E）分別選擇具有代表性的棉花黃萎病重度發(fā)生棉田與無(wú)?。ㄝp度）對(duì)照棉田各1塊，3地共計(jì)6塊棉田（表1）。重病田采集發(fā)病等級(jí)3以上棉株根圍土，對(duì)照田采集健康棉株根圍土，于4月與8月份每塊棉田3點(diǎn)取樣2次，每取樣點(diǎn)間隔50 m，每點(diǎn)取0—10 cm土層小樣5份，每份200 g，混合為1份樣品，每采樣時(shí)期計(jì)18份混合樣品，共36份混合樣品，經(jīng)2 mm孔徑過(guò)樣篩處理，保存于-80℃冰箱備用。

1.2 棉田發(fā)病程度調(diào)查

每塊取樣棉田調(diào)查5點(diǎn)，每點(diǎn)調(diào)查100株棉花，按照國(guó)內(nèi)棉花黃萎病統(tǒng)一分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算每塊取樣棉田病情指數(shù)。病情指數(shù)=[∑（各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×4）]×100。

1.3 采樣棉田信息

阿克蘇棉花黃萎病重病田（Aksu disease，AD）為自然棉田，以相鄰的棉花黃萎病重病田經(jīng)水稻輪作后的無(wú)病棉田（Aksu control，ACK）為對(duì)照，種植棉花品種均為中棉49號(hào)；石河子棉花黃萎病重病田（Shihezi disease，SD）、輕病對(duì)照田（Shihezi control，SCK）均為自然棉田，種植棉花品種均為新陸早64號(hào)；庫(kù)爾勒重病田（Korla disease，KD）為連續(xù)3年在無(wú)病田中人工接種棉花黃萎病菌改造而來(lái)，以相鄰無(wú)病田（Korla control，KCK）為對(duì)照，種植品種均為新陸中66號(hào)。以上棉田均為覆膜滴灌棉田，每個(gè)區(qū)域重病田與對(duì)照田的管理措施一致。棉田發(fā)病程度、土壤中微菌核量、土壤養(yǎng)分指標(biāo)等數(shù)據(jù)已另文發(fā)表[17]。

1.4 土壤總DNA的提取與文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序

利用北京百泰克生物技術(shù)公司生產(chǎn)的DP4001土壤試劑盒，嚴(yán)格按照操作步驟提取土壤總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量，使用Nano Drop 2000 UV-Vis光譜儀測(cè)定DNA濃度，總量滿足3次及以上建庫(kù)要求。所用引物為真菌ITS1區(qū)域引物：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，5′-GCTGCG TTCTTCATCGATGC-3′；內(nèi)部ITS1F：AACCTGCGG AAGGATCATT，內(nèi)部ITS1R：GARCCAAGAGATCC RTTG。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。由北京百邁客生物科技有限公司構(gòu)建DNA文庫(kù)，采用Illumina Hiseq 2500 PE250模式進(jìn)行測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

對(duì)測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)使用FLASH V1.2.7軟件，按照最小重疊長(zhǎng)度10 bp、重疊區(qū)最大錯(cuò)配比率0.2對(duì)每個(gè)樣品的序列進(jìn)行拼接，得到的拼接序列即原始序列。將拼接得到的序列用Trimmomatic軟件設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，截去后端堿基，過(guò)濾質(zhì)控后長(zhǎng)度小于標(biāo)簽長(zhǎng)度75%的標(biāo)簽，使用UCHIME軟件并去除嵌合體，得到高質(zhì)量的序列。

在相似性97%的水平上使用UCLUST軟件對(duì)序列進(jìn)行聚類(lèi)，以所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過(guò)濾OTU。在Unite真菌ITS數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。在置信度閾值為0.8利用RDP Classifier軟件進(jìn)行物種注釋分類(lèi)，作圖時(shí)將豐度低于1%的物種合并為Others在圖中顯示，Unknown代表未得到分類(lèi)學(xué)注釋的OTU。利用ClustalW2軟件進(jìn)行多重比對(duì)，鄰接法（neighbor- joining，NJ）建樹(shù)。利用Mothurversion V.1.30軟件進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)分析，包括Chao1豐富度估計(jì)量（Chao1 richness estimator）、Ace豐富度估計(jì)量（Ace richness estimator）、香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)（Shannon- wiener diversity index）與辛普森多樣性指數(shù)（Simpson diversity index）；基于Binary jaccard、Bray curtis多種算法呈現(xiàn)物種多樣性矩陣，進(jìn)行Beta多樣性分析（≥3），基于R語(yǔ)言平臺(tái)繪制樣本非度量多維尺度分析（NMDS）以及環(huán)境因子與樣本組成相關(guān)性分析（RDA）。利用LefSe分析方法設(shè)定顯著差異的LDA值為4.0，尋找組間豐度差異顯著物種，采用線性判別分析（LDA）來(lái)估算每個(gè)組分（物種）豐度對(duì)差異效果的影響。

表1 棉田土壤樣品

利用Excel軟件對(duì)常規(guī)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、匯總，利用SPSS19.0軟件的ANOVA程序中Duncan分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 黃萎病不同發(fā)生程度棉田真菌多樣性

在97%相似度水平下，AD和SD樣品4月和8月份采集的土壤中真菌的OTU數(shù)量、Chao1豐富度指數(shù)、Ace豐富度指數(shù)均分別高于其對(duì)照ACK、SCK樣品，而辛普森指數(shù)均分別低于對(duì)照。其中SD與SCK樣品的OTU數(shù)量存在顯著性差異。人工接菌的KD樣品與對(duì)照在OTU數(shù)量、Chao1豐富度指數(shù)、Ace豐富度指數(shù)、辛普森指數(shù)方面均極為接近，兩組樣品之間無(wú)顯著差異。分析表明，自然發(fā)病的重病田中真菌的豐度相比輕病或無(wú)病田有所上升而多樣性下降，而人工接入病原菌短期內(nèi)未對(duì)土壤中真菌的豐度和多樣性產(chǎn)生較大影響（表2）。

NMDS分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)應(yīng)力值=0.1396時(shí)，阿克蘇樣品主要分布在第Ⅲ象限，其中AD樣品的4月與8月份樣品距離較近，表現(xiàn)出較高的相似性；ACK樣品的4月與8月份樣品同樣表現(xiàn)出較高的相似性。石河子樣品主要分布在第Ⅱ象限，其中SD樣品的4月、8月份樣品距離近，相似性較高；而SCK樣品的4月與8月份樣品距離較遠(yuǎn)，樣品中真菌群落相似差異較大。庫(kù)爾勒樣品主要集中在第Ⅰ、Ⅳ象限，KD與KCK兩組樣品的4月份樣品距離較近，相似性較高，但與8月份樣品距離較遠(yuǎn)，差異較大。不同區(qū)域土壤樣品之間表現(xiàn)出不同的時(shí)空趨向性（圖1）。AD、SD中土壤樣品首先表現(xiàn)為明顯的空間趨向性，之后表現(xiàn)為時(shí)間趨向性，而庫(kù)爾勒土壤樣品則受采樣時(shí)間因素影響較大，其次是空間趨向性。

2.2 黃萎病不同發(fā)生程度棉田土壤真菌群落組成

在門(mén)水平上，Ascomycota（64.15%—82.10%）的豐度在不同樣品中均占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在AD、KD、SD樣品中豐度均分別低于其對(duì)照；而B(niǎo)asidiomycota和Mortierellomycota則在AD、KD、SD樣品中豐度均分別高于其對(duì)照。Ascomycota、Basidiomycota以及Mortierellomycota在庫(kù)爾勒KD（74.14%、15.07%、3.87%）與其對(duì)照KCK樣品（75.07%、14.59%、3.57%）之間以及石河子SD（76.42%、12.96%、3.58%）和其對(duì)照SCK樣品（82.10%、10.34%、2.78%）之間豐度相差較小，而在阿克蘇AD（64.15%、18.84%、5.62%）樣品和其對(duì)照ACK（80.27%、9.69%、2.67%）樣品之間豐度差異較大，表明病原菌的接入對(duì)土壤中門(mén)水平優(yōu)勢(shì)真菌群落的影響較小，而ACK樣品取樣田前茬種植水稻則明顯地影響了土壤中門(mén)水平優(yōu)勢(shì)真菌的豐度（圖2）。

表2 土壤中真菌的Alpha多樣性指數(shù)

同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（＜0.05）

Different lowercases after data in the same column indicate significant difference (＜0.05)

A4：石河子重病田（4月） Serious disease fields of Shihezi (April); B4：A4對(duì)照The control of A4；A8：石河子重病田（8月）Serious disease fields of Shihezi (August)；B8：A8對(duì)照The control of A8；C4：庫(kù)爾勒重病田（4月）Serious disease fields of Korla (April)；D4：C4對(duì)照The control of C4；C8：庫(kù)爾勒重病田（8月）Serious disease fields of Korla (August)；D8：C8對(duì)照The control of C8；E4：阿克蘇重病田（4月）Serious disease fields of Aksu (April)；F4：E4對(duì)照The control of E4；E8：阿克蘇重病田（8月）Serious disease fields of Aksu (August)；F8：E8對(duì)照The control of E8

圖2 土壤中門(mén)（左圖）和屬（右圖）分類(lèi)水平的真菌群落結(jié)構(gòu)

在屬水平上，土壤中的豐度最高，其與在不同區(qū)域重病田土壤中豐度均高于對(duì)照，其中在AD樣品中的豐度（17.53%）約為ACK樣品（8.79%）的2倍；而在不同處理的對(duì)照田中均高于重病田。此外，AD樣品中、、、、均低于ACK樣品，而、、在SD樣品中的豐度均高于SCK（圖2）。

組間差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)設(shè)定LDA值＞4時(shí)，不同組樣品之間具有顯著性差異的標(biāo)記極少。當(dāng)設(shè)定LDA值＞3時(shí)，庫(kù)爾勒土壤中的顯著差異標(biāo)記均富集于KD樣品組中，包括Aphelidiomycota、Aphelidiomycetes、、等。石河子土壤SD樣品中富集的顯著差異標(biāo)記為10個(gè)，包括Dothideomycetes、、和等，而SCK樣品中僅3個(gè)，包括Sordariales、Lasiosphaeriaceae和。阿克蘇土壤中顯著差異標(biāo)記主要富集于ACK樣品中，有別于石河子和庫(kù)爾勒土壤，ACK組樣品中的差異標(biāo)記包括Hypocreales、Nectriaceae、和等，表明該棉田前茬種植水稻對(duì)土壤中真菌的組成產(chǎn)生了較大影響（圖3）。

2.3 真菌多樣性、群落結(jié)構(gòu)與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性

相關(guān)性分析表明，土壤的pH以及全磷、全鉀含量與真菌的辛普森指數(shù)的相關(guān)系數(shù)分別為0.7799、0.6209和0.8848，總鹽與辛普森指數(shù)顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.7604，但以上指標(biāo)均與OTU數(shù)量、Chao1豐富度、Ace豐富度的相關(guān)性低。有機(jī)質(zhì)、全氮量與真菌的OTU數(shù)量、Chao1豐富度、Ace豐富度呈顯著正相關(guān)，但與辛普森指數(shù)相關(guān)性低（表3）。

圖3 不同處理組間差異顯著性分析

表3 土壤養(yǎng)分、pH及有機(jī)質(zhì)與真菌多樣性指數(shù)的相關(guān)性

冗余分析表明，土壤中的真菌種群主要與土壤養(yǎng)分明顯相關(guān)，其中、、、、等與全鹽量呈正相關(guān)，主要集中在第Ⅲ象限，、、、與含鹽量成負(fù)相關(guān)，集中在第Ⅰ象限；而、、、、與土壤中有機(jī)質(zhì)、全氮量呈正相關(guān)，集中在第Ⅳ象限，與之呈顯著負(fù)相關(guān)（圖4）。

3 討論

病原菌侵染作物后，能使其根部發(fā)生組織結(jié)構(gòu)變化的同時(shí)，也可改變其分泌物中某些成分及含量，根系分泌物是植物與土壤進(jìn)行物質(zhì)交換的載體，在調(diào)節(jié)植物與土壤微生物互作方面發(fā)揮著重要作用[18]，當(dāng)改變的根系分泌物擴(kuò)散到土壤后，影響了作物根際的土壤環(huán)境，從而致使作物根際微生物數(shù)量及種類(lèi)發(fā)生特定變化[19-20]。已有研究表明，棉花黃萎病發(fā)生能夠引起其根際土壤中真菌的富集，土壤中真菌數(shù)量、致病真菌種類(lèi)均明顯增加[10-11]，在糧食、蔬菜等作物上亦得出一致的結(jié)論[12-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，阿克蘇、石河子重病棉田發(fā)病棉花根圍土中真菌的OTU數(shù)量、豐度在兩個(gè)采樣時(shí)期均高于無(wú)病田或輕病田中的健康棉株根圍土，而真菌的多樣性降低，其中阿克蘇重病田與種植過(guò)水稻的對(duì)照棉田之間存在顯著差異，該結(jié)果與前人研究基本一致。但是，棉田接種病原菌處理（KD）土壤中真菌的OUT數(shù)量、豐度與其對(duì)照相比雖無(wú)顯著差異，卻略低于對(duì)照，且AD、SD樣品中真菌群落首先表現(xiàn)為空間趨向性，之后為時(shí)間趨向性，而庫(kù)爾勒土壤樣品則受采樣時(shí)間因素影響更大，其次是空間因素，兩方面結(jié)果均與阿克蘇、石河子自然發(fā)病棉田數(shù)據(jù)不一致，反映了病原菌入侵短期內(nèi)對(duì)土壤中真菌的豐度、多樣性和組成影響有限，推測(cè)可能與接種年限或植物根際分泌物的影響范圍有關(guān)，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

含鹽量Total salt content；全氮量 Total nitrogen content；有機(jī)質(zhì) Organic matter content

前人研究認(rèn)為，土壤養(yǎng)分、pH、有機(jī)質(zhì)等是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素[21-22]，Yu等[23]研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥處理后土壤中細(xì)菌、放線菌的群落多樣性、香農(nóng)指數(shù)升高，氮肥處理后真菌水平升高。本研究發(fā)現(xiàn)不同分類(lèi)水平真菌的組成存在差異，在門(mén)分類(lèi)水平上，土壤中豐度高的真菌子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)與Mortierellomycota在庫(kù)爾勒人工接菌棉田與其對(duì)照之間以及石河子自然發(fā)病棉田與其對(duì)照之間的豐度差異較小，而在阿克蘇重病田與其水稻輪作處理的對(duì)照之間豐度差異較大。在屬分類(lèi)水平上，不同區(qū)域土壤中除擲孢酵母屬、被孢霉屬和的豐度在重病田與對(duì)照田之間變化一致外，其余菌屬在不同處理組內(nèi)豐度無(wú)一致變化規(guī)律。作為驗(yàn)證病害發(fā)生對(duì)土壤中真菌影響程度的人工接菌土壤（KD、KCK），其在土壤真菌的豐度、多樣性和組成的變化方面均與自然發(fā)病棉田處理組間無(wú)明顯差異，因此認(rèn)為發(fā)病程度可能對(duì)棉花根圍土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響有限，為此，研究了土壤養(yǎng)分等指標(biāo)與真菌的多樣性以及群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性。利用相關(guān)性和RDA分析表明，全氮、有機(jī)質(zhì)、含鹽量、全鹽、pH等指標(biāo)對(duì)土壤中真菌多樣性、群落組成的影響顯著，這與王巍巍等研究結(jié)果一致[24-26]。

棉花黃萎病防治困難，明確土壤中大麗輪枝菌的動(dòng)態(tài)以及大麗輪枝菌入侵棉田與土壤中真菌群落的動(dòng)態(tài)關(guān)系，對(duì)于利用微生態(tài)調(diào)控措施防控棉花黃萎病具有重要意義。前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)水稻輪作棉田（ACK）不僅提高了土壤肥力，還消滅了土壤中的大麗輪枝菌，杜絕了病害發(fā)生；而棉田地力水平最高、連作達(dá)30年的重病棉田（SD）土壤中，大麗輪枝菌菌源數(shù)量卻高達(dá)193個(gè)/g土[17]。本研究表明，在土壤中含有病原菌的前提下，不改變種植作物以及栽培模式，僅改善土壤肥力可能加重病害的發(fā)生。而通過(guò)不同作物間作、輪作和種植抗病品種等，利用不同作物根系分泌的化感物質(zhì)持續(xù)對(duì)土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)節(jié)，增加土壤中有益菌群數(shù)量，降低病原菌數(shù)量，在“農(nóng)藥、化肥”雙減戰(zhàn)略下可能是防控土傳病害的有效手段。

4 結(jié)論

自然發(fā)病重棉田土壤中真菌的OTU數(shù)量、豐度均高于輕病或無(wú)病田，但多樣性降低；而棉田內(nèi)人工接種大麗輪枝菌短期內(nèi)并未對(duì)土壤中真菌的豐度、多樣性和群落結(jié)構(gòu)造成明顯影響。相關(guān)性分析表明，土壤中真菌的多樣性、豐度和組成主要受有機(jī)質(zhì)、全氮、含鹽量等指標(biāo)決定，且采樣時(shí)期同樣對(duì)土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)有明顯影響。

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Fungal Community Structure of Cotton-Field soil under different incidences of CottonWilt

LIU HaiYang1, WANG Wei1, ZHANG RenFu1, Raxida·Abdurahman2, YAO Ju1

(1Institute of Plant Protection, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northwestern Oasis, Ministry of Agriculture,Urumqi 830091;2Agricultural Technology Extension Station of Yining County, Yining 835000, Xinjiang)

【Objective】Fungus is an important part of soil microbial system, which can obviously indicate the change of soil environment. The objective of this study is to analyze the characteristics of fungal communities in cotton-field soil with different incidences ofwilt, determine the effect ofon the diversity and community structures of fungi in cotton fields, and to reveal the ecological function of fungi community in soil during the occurrence ofwilt.【Method】Cotton fields with different incidences ofwilt in Aksu and Shihezi, and artificially inoculated cotton field in Korla were chosen as research objects. Six soil samples collected from serious diseased fields in Aksu (AD), Korla (KD), Shihezi (SD) and their controls were tested, respectively. Illumina Hiseq high-throughput sequencing technique was used to study the diversity and community structure of fungi in soil. The correlation between fungal community structure and soil nutrients was clarified with redundancy analysis (RDA).【Result】At the similarity level of 97%, the OTU number, Chao1 and Ace richness index of fungi in AD and SD samples were higher than those of ACK and SCK samples, while the simpson index was lower than that of control. There was no significant difference in OTU number,Chao1 and Ace richness index and Simpson index between artificially inoculated KD and control KCK samples.NMDS analysis showed that the soil samples of AD and SD had spatial tendency first and then temporal tendency, while the soil samples in Korla had temporal tendency first and then spatial tendency. In terms of community composition, at the phylum level, the abundance of Ascomycota in soil was dominant, followed by Basidiomycota and Mortierellomycota.The abundance differences of the three phylum groups between KD and KCK samples and between SD and SCK samples were relatively small, while those between AD and ACK samples were relatively larger. At the genus level,had the highest abundance, and the abundances of bothandwere higher than those of the control in the soils of seriously diseased field in different regions, butwas lower than that of the control. In addition, the abundance of,andin AD samples was lower than that of ACK samples, while the abundance of these three genera in SD samples was higher than that of SCK samples. The significant difference analysis among groups indicated that the significant difference markers in Korla and Shihezi soils were mainly concentrated in the seriously diseased fields, while in Aksu soils they were mainly concentrated in disease-free fields. Correlation and RDA analysis showed that soil organic matter and total nitrogen content were positively correlated with OTU number and abundance of fungi, but had low correlation with Simpson index. The pH, total phosphorus and total potassium were positively correlated with Simpson index, while total salt was negatively correlated with Simpson index.【Conclusion】The OTU number and abundance of fungi in the soil of natural seriously diseased cotton fields are higher than those in the control, but the diversity of fungi is low. In the short term, artificial inoculation does not have significant effects on the abundance, diversity and community structure of the fungi in the soil. The diversity, abundance and composition of fungi in soil are significantly affected by the indexes of organic matter, total nitrogen and salt content. The sampling period also has significant effects on the community structure of fungi in soil.

; cottonwilt;invasion; cotton-field soil; fungal community; high-throughput sequencing

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.03.006

2018-08-07；

2018-11-16

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0201106）、新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（KY201807）

劉海洋，E-mail：xaaslhy@126.com。通信作者姚舉，E-mail：yaoju500@sohu.com

（責(zé)任編輯 岳梅）