方志雄 徐 磊 張海明 林 沙

(湖南省湘潭市中心醫(yī)院感染科，湘潭市 411100，電子郵箱：fzx8214907@163.com)

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌(MycobacteriumTuberculosis，MTB)引起的傳染性疾病，在全世界范圍內(nèi)均具有較高的發(fā)病率，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)告，2015年全球結(jié)核病患病人數(shù)已超過(guò)800萬(wàn)，其中近100萬(wàn)患者因肺結(jié)核死亡[1]。目前診斷肺結(jié)核的主要手段為細(xì)菌學(xué)檢測(cè)，但常規(guī)痰涂片的敏感性較低，而痰培養(yǎng)的周期長(zhǎng)達(dá)1～2個(gè)月，時(shí)效性不佳[2]。流行病學(xué)研究表明，只有5%～10%感染MTB的患者最終會(huì)發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核[3]，這表明人體免疫系統(tǒng)具有較強(qiáng)的保護(hù)力，能夠有效地抑制體內(nèi)MTB的繁殖以防止發(fā)展成活動(dòng)性疾病。CD4+T淋巴細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞中的重要亞群，在細(xì)胞免疫中發(fā)揮了重要作用，其狀態(tài)與結(jié)核活動(dòng)密切相關(guān)。而CD27是腫瘤壞死因子受體家族的成員，在細(xì)胞免疫中具有重要作用[4]。目前，關(guān)于結(jié)核病患者血液和痰液中CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平的研究較少，且其對(duì)新發(fā)結(jié)核病的診斷價(jià)值仍未明確。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年6月至2017年6月間在我院確診的33例新發(fā)肺結(jié)核Ⅰ型進(jìn)展期患者為新發(fā)組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)，經(jīng)痰涂片或痰培養(yǎng)確診為肺結(jié)核的新發(fā)患者；(2)未經(jīng)抗結(jié)核藥物治療；(3)不存在免疫系統(tǒng)疾病和血液系統(tǒng)疾??；(4)近3個(gè)月未服用增強(qiáng)或抑制免疫的藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)先天性或獲得性免疫功能異?；颊?；(2)合并其他肺部感染患者；(3)存在惡性腫瘤和嚴(yán)重肝腎功能障礙患者。選擇同期經(jīng)抗結(jié)核藥物治療后細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果為陰性的33例肺結(jié)核患者為經(jīng)治組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往臨床表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)符合肺結(jié)核，并經(jīng)痰涂片或痰培養(yǎng)確診為肺結(jié)核，并經(jīng)抗結(jié)核藥物治療后痊愈(痊愈定義為痰涂片陽(yáng)性肺結(jié)核患者完成規(guī)定療程，連續(xù)2次痰涂片結(jié)果陰性，其中1次是治療末[5])；(2)痰培養(yǎng)結(jié)核桿菌陰性；(3)近3個(gè)月未服用增強(qiáng)或抑制免疫的藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)同新發(fā)組。另選擇同時(shí)期、同年齡段的33例健康者作為對(duì)照組。3組患者的年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)及外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。

表1 3組患者的一般資料

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑與儀器：淋巴細(xì)胞提取液(美國(guó)GE醫(yī)療，批號(hào)：150311)，改良RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma，批號(hào)：160243)，藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的鼠抗人CD4、CD154和CD27抗體(英國(guó)Biorbyt公司，批號(hào)：141209、141104、150104)；皮內(nèi)注射用卡介苗(陜西醫(yī)藥控股，國(guó)藥準(zhǔn)字：S10960096；0.25 mg/支；批號(hào)：150903)。CytomicsTMFC 500全自動(dòng)五色數(shù)字化流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)；7E-A/B吸痰器(魚躍醫(yī)療)。

1.2.2 血標(biāo)本處理：抽取所有研究對(duì)象靜脈血2 mL至乙二胺四乙酸抗凝管中，混勻后，將1.5 mL血標(biāo)本加到15 mL淋巴細(xì)胞提取液表面，以2 000 r/min離心20 min，隨后分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，依照淋巴細(xì)胞提取液說(shuō)明書進(jìn)行分離。

1.2.3 痰液標(biāo)本處理：誘導(dǎo)排痰參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行，取2 mL痰液經(jīng)吸痰器過(guò)濾器濾過(guò)后置于4℃保存。1.5 mL痰液加到15 mL淋巴細(xì)胞提取液表面，以2 000 r/min離心20 min，隨后分離PBMC，依照淋巴細(xì)胞提取液說(shuō)明書進(jìn)行分離。

1.2.4 抗原刺激與熒光染色：將從血液和痰液中分離的PBMC分別加入96孔平底帶蓋無(wú)菌培養(yǎng)板中，每孔100 μL；之后每孔依次加入10 μL的10 μg/L卡介苗和10 μL PE標(biāo)記的CD154抗體(滴度1 ∶64)，37℃培養(yǎng)16～20 h后分別加入CD4和CD27 PE熒光抗體染色劑(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：151270)10 μL進(jìn)行染色；再次培養(yǎng)16～20 h后使用磷酸緩沖鹽溶液各進(jìn)行1次洗滌和重懸；重懸后每孔加入3 μL抗體濃度為25 mg/mL PE標(biāo)記CD4抗體和8 μL抗體濃度為25 mg/mL PE標(biāo)記CD27抗體，避光染色30 min后，加入300 μL固定/破膜劑(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：160183)，振蕩均勻，室溫放置20 min；以1 200 r/min離心5 min去除上清液，加入檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子用的5 μL熒光素標(biāo)記抗體(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：160836)，混合均勻，室溫避光孵育20 min；用1 mL磷酸緩沖鹽溶液重懸洗滌細(xì)胞，以1 200 r/min離心5 min去除上清液。磷酸緩沖鹽溶液各進(jìn)行1次洗滌和重懸，將樣本置于4℃避光條件下保存待檢。

1.2.5 CD27表達(dá)檢測(cè)：按照流式細(xì)胞儀操作手冊(cè)進(jìn)樣后使用配套CXP軟件進(jìn)行分析。從選取的淋巴細(xì)胞中以 CD4-PE-Cy5、CD154-PE設(shè)立橫縱坐標(biāo)，建立二維點(diǎn)圖，通過(guò)CD4+CD154+T淋巴細(xì)胞門圈出CD4+T淋巴細(xì)胞(見(jiàn)圖1A)；從選取的CD4+T淋巴細(xì)胞中以CD27-PE-Cy7門圈出CD27+的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群(見(jiàn)圖1B)。樣本細(xì)胞數(shù)均≥105個(gè)。

圖1 CD4+T淋巴細(xì)胞及表達(dá)CD27+CD4+T淋巴細(xì)胞的典型流式細(xì)胞分析圖像

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。服從正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t法；不服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用M(P25，P75)表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線及曲線下面積(area under the curve，AUC)評(píng)價(jià)血液和痰液中CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平診斷新發(fā)肺結(jié)核的效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組血液和痰液中CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平 3組血液和痰液中CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；其中，新發(fā)組血液和痰液中CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平高于經(jīng)治組和對(duì)照組，而經(jīng)治組血液和痰液中CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平低于對(duì)照組(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表23組血液和痰液中CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平[M(P25，P75)，%]

組別n血液痰液新發(fā)組3376.61(71.39,85.80)ab80.32(76.07,88.61)ab經(jīng)治組3333.15(24,46.02)a40.12(28.25,48.90)a對(duì)照組3360.14(54.45,68.54)56.17(46.66,66.15)H值63.16166.592P值<0.001<0.001

注：a與對(duì)照組比較，P<0.05；b與經(jīng)治組比較，P<0.05。

2.2 血液和痰液中CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平診斷新發(fā)肺結(jié)核的效能 以是否診斷為新發(fā)肺結(jié)核為狀態(tài)變量(新發(fā)患者為陽(yáng)性，經(jīng)治患者和對(duì)照人群為陰性)，以血液和痰液中CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平為自變量進(jìn)行ROC曲線分析。結(jié)果顯示，血液和痰液中CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平診斷新發(fā)肺結(jié)核的AUC分別為0.883和0.912，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(z=0.725，P=0.468)。見(jiàn)表3和圖2。

表3 血液和痰液中CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平診斷新發(fā)肺結(jié)核的ROC曲線分析結(jié)果

圖2 血液和痰液中CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平診斷新發(fā)肺結(jié)核的ROC曲線

3 討 論

目前，結(jié)核的診斷和治療技術(shù)已取得了巨大進(jìn)步，但肺結(jié)核的疫情并未得到顯著控制[7]。隨著我國(guó)城市化進(jìn)程的加快和人口流動(dòng)性的增加，肺結(jié)核的診斷、治療和管理的困難增大[8]。控制結(jié)核的傳播依賴于有效的診斷與監(jiān)測(cè)方法，而常用的微生物學(xué)檢查、結(jié)核菌素試驗(yàn)和胸部影像學(xué)檢查均有較大的局限性。MTB的感染和活動(dòng)與T淋巴細(xì)胞的功能狀態(tài)高度相關(guān)，而基于T淋巴細(xì)胞分析的免疫學(xué)檢測(cè)用于結(jié)核的診斷和監(jiān)測(cè)具有很高的潛力。相關(guān)研究顯示，γ干擾素釋放試驗(yàn)已用于檢測(cè)MTB感染[9]，表現(xiàn)出了較高的敏感性[10]，但對(duì)于活動(dòng)性結(jié)核、潛伏性結(jié)核和經(jīng)治結(jié)核的診斷能力較差[11]。CD27是一種跨膜糖蛋白，也是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，主要分布于活化的T淋巴細(xì)胞表面，被認(rèn)為是T淋巴細(xì)胞激活和炎癥反應(yīng)的一種標(biāo)志物[12]。研究顯示，CD27是記憶T淋巴細(xì)胞形成的必需組分，CD27通過(guò)與CD70結(jié)合，可以誘導(dǎo)核因子κB通路的激活，并極大地增強(qiáng)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞應(yīng)答[13]，而敲除CD27的小鼠的記憶T淋巴細(xì)胞對(duì)刺激二次應(yīng)答明顯降低[14]。動(dòng)物模型研究顯示，與野生型小鼠相比，敲除CD27基因的小鼠感染病毒和MTB時(shí)，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的數(shù)量減少，其中CD4+T淋巴細(xì)胞減少最為明顯[15]，這提示CD4+T淋巴細(xì)胞CD27的表達(dá)水平或許可用于結(jié)核病的診斷。

結(jié)核患者的免疫系統(tǒng)功能明顯異常，其中T淋巴細(xì)胞的亞群構(gòu)成改變更為顯著，多項(xiàng)基于中國(guó)人群或歐美人群的免疫學(xué)研究結(jié)果均顯示，結(jié)核患者CD4+T淋巴細(xì)胞的比例和功能狀態(tài)均明顯降低[16-18]?？ń槊缡桥R床常用的結(jié)核疫苗，在結(jié)核病的免疫研究中也有重要作用，經(jīng)卡介苗刺激后產(chǎn)生的T淋巴細(xì)胞具有高度的結(jié)核相關(guān)特異性，可以反映機(jī)體對(duì)于MTB的免疫狀態(tài)[19]。因此，本研究采用卡介苗對(duì)血液及痰液標(biāo)本進(jìn)行抗原刺激后，分析新發(fā)肺結(jié)核患者、經(jīng)治肺結(jié)核患者以及健康對(duì)照人群血液和痰液中特異性CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平。結(jié)果顯示，新發(fā)肺結(jié)核患者血液和痰液中特異性CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平高于經(jīng)治組和對(duì)照組(均P<0.05)。這提示血液和痰液中特異性CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平可能與結(jié)核感染狀態(tài)相關(guān)，與Nikitina等[20]的研究結(jié)果相似。ROC曲線分析結(jié)果顯示，應(yīng)用血液和痰液中CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平診斷新發(fā)肺結(jié)核的價(jià)值均較高，但兩者的AUC差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Petruccioli等[21]的研究結(jié)果顯示，血液特異性CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平對(duì)結(jié)核患者特別是潛伏性結(jié)核患者，具有較好的診斷價(jià)值；Schuetz等[22]在針對(duì)合并HIV感染的結(jié)核患者的研究中也得出了類似結(jié)論；Portevin等[23]的研究結(jié)果顯示，基于T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平的TAM-TB檢驗(yàn)用于診斷兒童結(jié)核病具有良好的敏感性和特異性。以上結(jié)果均提示將CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平應(yīng)用于診斷結(jié)核病具有較大潛力。

綜上所述，肺結(jié)核患者血液和痰液中特異性CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平明顯降低，而新發(fā)結(jié)核患者更為明顯；血液和痰液中CD4+T淋巴細(xì)胞CD27表達(dá)水平對(duì)新發(fā)肺結(jié)核的診斷效能均較好。但本研究為單中心小樣本的觀察性研究，受限于納入人群范圍和樣本量，相應(yīng)的診斷截點(diǎn)值用于其他人群的效果尚需下一步多中心大樣本研究進(jìn)一步明確。