錢敏健 李星軍 陸秀英 曹 萍 秦 云 張 莉

(1 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院檢驗(yàn)科,上海市 202150,電子郵箱：13918656271@139.com；2 同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第十人民醫(yī)院崇明分院檢驗(yàn)科,上海市 202157；3 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院崇明分院檢驗(yàn)科,上海市 202153)

尿路感染是最常見的泌尿系統(tǒng)疾病。全球每年有1億5千萬至2億5千萬尿路感染新發(fā)病例[1]。大腸桿菌是社區(qū)獲得性尿路感染(community acquired urinary tract infection,CA-UTI)最常見的病原菌之一。隨著廣譜抗菌藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用,耐藥大腸桿菌不斷增多,特別是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs )大腸桿菌,往往表現(xiàn)為多重耐藥,導(dǎo)致臨床治療陷入較大的困境。由于不同國家和地區(qū)抗菌藥物使用模式、菌株間耐藥性傳播方式不同,產(chǎn)ESBLs大腸桿菌流行的型別也有所不同,且不同亞型ESBLs大腸桿菌的耐藥譜存在一定差異[2]。崇明島是中國第三大島嶼,人口約82.15萬,目前未見有關(guān)崇明島CA-UTI患者產(chǎn)ESBLs大腸桿菌流行情況的研究報(bào)道。本研究通過調(diào)查崇明島大腸桿菌所致CA-UTI的病原體分布特點(diǎn)、產(chǎn)ESBLs大腸桿菌流行的主要基因型別及耐藥特點(diǎn),從而建立流行病學(xué)資料,以期有效指導(dǎo)當(dāng)?shù)嘏R床抗感染治療,減少多重耐藥大腸桿菌的出現(xiàn)及其耐藥性傳播。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 菌株分離自2016年1～12月崇明島開展臨床微生物培養(yǎng)的三家醫(yī)院(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院、同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第十人民醫(yī)院崇明分院和上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院崇明分院)的門﹑急診和入院48 h內(nèi)確診的CA-UTI患者的尿液,并剔除同一病例相同部位重復(fù)分離的大腸桿菌,分離后保存在甘油/牛肉湯保存液中,儲(chǔ)藏于-20℃冰箱內(nèi)。本研究共收集272株大腸桿菌。尿路感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]：存在相應(yīng)的臨床癥狀，尿沉渣白細(xì)胞≥10 個(gè)/高倍鏡視野,清潔中段尿培養(yǎng)病原菌2種及以下且計(jì)數(shù)≥105CFU/mL。CA-UTI定義：在院外或入院48 h內(nèi)確診的尿路感染[3]。以大腸桿菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603為質(zhì)控菌株,均購于上海市臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 主要儀器與試劑 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(西門子公司，MicroScan Walkway 96型),低溫高速離心機(jī)(Thermo scientific公司，SL16R型),CFX96型PCR擴(kuò)增儀、PowerPac Basic電泳儀、Bio-Rad ChemiDocTMXRS+凝膠成像儀(上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)。哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基(上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司),藥敏紙片(英國Oxiod公司),Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司，批號：C805KA3435],2*Es Taq MasterMix(Dye)(康為世紀(jì)，批號：CW0690M)，10×PCR緩沖液﹑6×DNA上樣緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：D7232-4、D0107)。

1.3 檢測方法

1.3.1 標(biāo)本采集：根據(jù)《臨床微生物學(xué)尿培養(yǎng)操作規(guī)程》[4]要求,取樣前女性用清洗液及滅菌紗布清洗外陰,男性用清洗液清洗尿道口消毒后用無菌尿杯留取清晨首次清潔中段尿,要在抗菌藥物使用前或避開抗菌藥物使用的血藥高峰取樣。尿標(biāo)本采集后應(yīng)立即送檢,不得超過2 h。

1.3.2 藥敏試驗(yàn)：取中段尿，離心沉淀后，用10 μL定量接種環(huán)垂直伸入尿液標(biāo)本取沉淀物。先在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基平板中心線上劃線，再在與此線垂直的方向左右連續(xù)劃線，從上而下完成劃線；35℃培養(yǎng)18～24 h，可得到圓形、稍凸、邊緣整齊、灰白色、不透明的菌落，采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀對尿標(biāo)本中的細(xì)菌菌種進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果為大腸桿菌后,采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)制訂的2016年版《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》[5]進(jìn)行判斷。

1.3.3 大腸桿菌表型確證試驗(yàn)[6]：采用酶抑制劑增強(qiáng)確證試驗(yàn)對大腸桿菌的表型進(jìn)行鑒定。在涂布大腸桿菌的MH瓊脂培養(yǎng)基上貼頭孢噻肟(30 μg)與頭孢噻肟/克拉維酸(30 μg/10 μg)、頭孢他啶(30 μg)與頭孢他啶/克拉維酸(30 μg/10 μg)兩組紙片,各紙片相距25 mm,35℃孵育18～20 h后取出查看結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)：兩組紙片任意一組后者與前者抑菌環(huán)直徑之差≥5 mm即判斷為ESBLs陽性。

1.3.4 β-內(nèi)酰胺酶基因型檢測：采用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為50 μL,具體見表1。各基因引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列和PCR反應(yīng)參數(shù)見表2。所得PCR產(chǎn)物行1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析；電泳時(shí)電壓120 V,時(shí)間30 min；電泳結(jié)束后采用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。β-內(nèi)酰胺酶基因分為SHV、TEM、CTX-M型別,根據(jù)PCR產(chǎn)物凝膠電泳條帶長度判定。采用大腸桿菌ATCC25922(非產(chǎn)ESBLs質(zhì)控株)作陰性對照,肺炎克雷伯菌ATCC700603(攜帶blaTEM、blaCTX-M、blaSHV)作陽性對照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見圖1。

表1 PCR反應(yīng)體系

表2 下游引物PCR擴(kuò)增引物序列及其反應(yīng)參數(shù)

A 部分CTX-M型β-內(nèi)酰胺酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

B 部分TEM型β-內(nèi)酰胺酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

C 部分SHV型β-內(nèi)酰胺酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

注：M為2 000 bp DNA Marker；1為陽性對照；2為陰性對照；3～10為標(biāo)本PCR產(chǎn)物。

1.3.5 β-內(nèi)酰胺酶基因各型別的測序和序列分析：將上述獲得的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測序,所測序列結(jié)果在BLAST在線工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中進(jìn)行序列比對分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用地理信息系統(tǒng)(Geographic Information System,GIS)描述大腸桿菌的空間分布特征。采用世界衛(wèi)生組織WHONET 5.6軟件分析大腸桿菌耐藥性分布情況。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 崇明島CA-UTIs患者的地區(qū)分布 崇明島CA-UTIs患者主要集中在城橋鎮(zhèn)、堡鎮(zhèn)、陳家鎮(zhèn)和廟鎮(zhèn)等地,而新村鄉(xiāng)、綠華鎮(zhèn)、新海農(nóng)場、前進(jìn)農(nóng)場分布較少，見圖2。共檢出147株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌，病例主要來源于城橋鎮(zhèn)、堡鎮(zhèn)、陳家鎮(zhèn)和廟鎮(zhèn)，見表3。

圖2 崇明島CA-UTIs患者的地區(qū)分布

注：圖中數(shù)字為各地區(qū)CA-UTIs患者例數(shù)占總例數(shù)的百分比；未標(biāo)注數(shù)據(jù)的地區(qū)無發(fā)病。

表3 崇明島不同地區(qū)大腸桿菌的檢出情況(n)

2.2 不同性別、年齡CA-UTIs患者大腸桿菌檢出情況 272株大腸桿菌中,80株來自男性患者,192株來自女性患者。在男性患者中，大腸桿菌主要在41～<91歲患者中檢出；其中有49株為產(chǎn)ESBLs大腸桿菌,其主要集中在41～<91歲人群,其余31株非產(chǎn)ESBLs大腸桿菌主要集中在61～<91歲人群。在女性患者中，大腸桿菌也主要在41～<91歲患者中檢出；其中有98株為產(chǎn)ESBLs大腸桿菌,其主要集中在41～<91歲人群,其余94株非產(chǎn)ESBLs大腸桿菌主要集中在61～<91歲人群。男性患者的產(chǎn)ESBLs大腸桿菌檢出率(61.3%,49/80)高于女性患者(51.0%,98/192),但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.369,P=0.123)。見表4。

2.3 大腸桿菌的耐藥性檢測結(jié)果 147株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌均未對碳青霉烯類藥物亞胺培南和美羅培南產(chǎn)生耐藥,對頭孢噻肟、頭孢呋辛和頭孢唑林的耐藥率最高,其次是環(huán)丙沙星和復(fù)方磺胺甲惡唑。125株非產(chǎn)ESBLs大腸桿菌均未對碳青霉烯類藥物亞胺培南和美羅培南產(chǎn)生耐藥,對環(huán)丙沙星的耐藥率最高,其次為復(fù)方磺胺甲惡唑和頭孢唑林。見表5。

表4 不同性別及年齡患者大腸桿菌檢出情況(n)

表5 大腸桿菌的耐藥性檢測結(jié)果

續(xù)表5

2.4 產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的基因型檢測結(jié)果 147株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中,123株獲得基因分型,其中CTX-M型菌株115株(93.5%),SHV型菌株12株(9.8%),TEM型菌株96株(78.0%)；有24株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌未獲得基因分型。

2.5 123株獲得基因分型的產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的基因測序結(jié)果 結(jié)果顯示,CTX-M型菌株耐藥基因的序列為CTX-M-14(45.2%,52/115)和CTX-M-15(54.8%,63/115)；TEM型菌株耐藥基因的序列均為TEM-1。有79.7%(98/123)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌攜帶2種耐藥基因,有1株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌同時(shí)攜帶3種耐藥基因。見表6。

2.6 不同基因型產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的耐藥性比較 3種基因型產(chǎn)ESBLs大腸桿菌對頭孢噻肟、頭孢呋辛和頭孢唑林等頭孢菌素類抗菌藥物的耐藥率均為100.0%,對環(huán)丙沙星的耐藥率也較高。不同基因型產(chǎn)ESBLs大腸桿菌對抗菌藥物的耐藥率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表7。

表6 123株獲得基因分型的產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的基因測序結(jié)果

表7 不同基因型產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的耐藥性比較

3 討 論

崇明島CA-UTI患者主要集中在城橋鎮(zhèn)(13.2%)、堡鎮(zhèn)(10.7%)和陳家鎮(zhèn)(9.9%)等地,新村鄉(xiāng)(3.3%)、綠華鎮(zhèn)(2.9%)、新海農(nóng)場(2.9%)、前進(jìn)農(nóng)場(2.9%)等地分布較少；產(chǎn)ESBLs大腸桿菌主要分布在來自城橋鎮(zhèn)、堡鎮(zhèn)、陳家鎮(zhèn)和廟鎮(zhèn)的患者,在新海農(nóng)場和前進(jìn)農(nóng)場的患者中未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌。造成這種分布差異的原因可能是產(chǎn)ESBLs的菌株可以通過結(jié)合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等形成耐藥基因在細(xì)菌間擴(kuò)散[7]，而城橋鎮(zhèn)、堡鎮(zhèn)、陳家鎮(zhèn)是崇明島的三大鎮(zhèn),人口較密集,這種環(huán)境下有助于耐藥基因在細(xì)菌間擴(kuò)散。本研究結(jié)果顯示,大腸桿菌所致的CA-UTI患者以女性為主,女性患者的產(chǎn)ESBLs大腸桿菌檢出率高于男性,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；無論在男性還是女性CA-UTI患者中,大腸桿菌均主要在41～<91歲患者中檢出,尤以61～<91歲人群最為集中。以上說明大腸桿菌更易在老年女性尿道定植,與羅馬尼亞布加勒斯特地區(qū)的調(diào)查結(jié)果相似[8],其主要原因是高齡所致的下尿路功能減退,以及泌尿生殖系統(tǒng)萎縮引起的生殖道菌群失調(diào)等[9]。

產(chǎn)ESBLs大腸桿菌往往表現(xiàn)為多重耐藥,可導(dǎo)致反復(fù)性、難治性尿路感染發(fā)生,這不僅給臨床治療帶來困難,也增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,了解大腸桿菌的耐藥性特點(diǎn),可為臨床合理用藥、減少多重耐藥菌株的產(chǎn)生提供依據(jù)。本研究結(jié)果顯示,分離自CA-UTI患者的大腸桿菌,無論產(chǎn)ESBLs與否,均未對碳青霉烯類抗菌藥物亞胺培南和美羅培南耐藥,而對哌拉西林/他唑巴坦和頭孢哌酮/舒巴坦等β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、呋喃妥因、阿米卡星和磷霉素的耐藥率均較低,與耿麗穎[10]的研究結(jié)果相似。因此在治療本地區(qū)大腸桿菌導(dǎo)致的尿路感染時(shí),上述這些抗菌藥物可作為經(jīng)驗(yàn)選擇藥物。本研究結(jié)果顯示,產(chǎn)ESBLs菌株對頭孢噻肟、頭孢呋辛和頭孢唑林的耐藥率最高,其次是環(huán)丙沙星、復(fù)方磺胺甲惡唑和慶大霉素,而非產(chǎn)ESBLs菌株對環(huán)丙沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑的耐藥率最高,提示產(chǎn)ESBLs菌株對第一、二、三代頭孢菌素類藥物均耐藥。此外，產(chǎn)ESBLs或非產(chǎn)ESBLs菌株均對氟喹諾酮類、磺胺類和氨基糖苷類(除阿米卡星)等藥物多重耐藥。因此,在治療崇明島大腸桿菌引起的CA-UTI患者時(shí),不建議將環(huán)丙沙星和復(fù)方磺胺甲惡唑作為經(jīng)驗(yàn)用藥,而應(yīng)將患者尿液標(biāo)本送檢,參考微生物實(shí)驗(yàn)室提供的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇用藥。

在本研究獲得基因型分型的123株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌中,CTX-M型菌株檢出率為93.5%,低于國內(nèi)其他研究結(jié)果(100%)[11],但高于印度的研究結(jié)果(70.2%)[12]。這說明不同國家和地區(qū)流行的基因型不同,可能與不同地區(qū)大腸桿菌攜帶的ESBLs基因耐藥質(zhì)粒不同有關(guān)。SHV在歐美國家檢出率高,在中國低,多見于重癥的院內(nèi)感染,社區(qū)感染較少,僅占3.0%[13]。在本研究中，SHV的檢出率為9.8%,稍高于上述結(jié)果。本研究中CTX-M型大腸桿菌的基因型主要為CTX-M-14和CTX-M-15,其耐藥特點(diǎn)為：未對碳青霉烯類抗菌藥物亞胺培南和美羅培南產(chǎn)生耐藥,對哌拉西林/他唑巴坦和頭孢哌酮/舒巴坦等β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的耐藥率較低,對頭孢噻肟、頭孢呋辛、頭孢唑林等頭孢菌素類抗菌藥物耐藥率最高,對環(huán)丙沙星耐藥率較高。因此，在崇明島治療此型產(chǎn)ESBLs大腸桿菌引起的CA-UTI時(shí)，可使用碳青霉烯類和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑等抗菌藥物。

流行病學(xué)研究表明,CTX-M基因正在取代SHV和TEM成為最常見的ESBL基因[14-16]。而CTX-M耐藥基因的傳播可能與其周圍基因元件有關(guān),位于CTX-M基因上游的IEScp基因可能對耐藥基因的傳播起重要作用[17]。本研究結(jié)果顯示,CTX-M型產(chǎn)ESBLs大腸桿菌耐藥基因的序列為CTX-M-14和CTX-M-15,與針對廣東湛江地區(qū)的研究結(jié)果[18]不盡相同,這可能與不同地區(qū)經(jīng)驗(yàn)用藥種類不同導(dǎo)致細(xì)菌耐藥基因突變或產(chǎn)生選擇性細(xì)菌耐藥株不同有關(guān)。此外，本研究中有79.7%產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌攜帶2種耐藥基因,高于浙江寧波地區(qū)的研究結(jié)果[13]。

綜上所述,崇明島大腸桿菌所致CA-UTI患者主要分布于城橋鎮(zhèn)、堡鎮(zhèn)和陳家鎮(zhèn),女性患者多于男性；CTX-M-14、CTX-M-15、TEM-1型是產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的主要基因型。在該地區(qū)治療由大腸桿菌引起的CA-UTI患者時(shí),不建議用氟喹諾酮類和磺胺類抗菌藥物作為臨床經(jīng)驗(yàn)用藥；建議臨床醫(yī)生送檢患者尿液標(biāo)本做細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)合耐藥株的耐藥基因檢測,合理使用抗生素,以控制多重耐藥大腸桿菌的發(fā)生和傳播。