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        骨癌痛嗎啡耐受疼痛模型大鼠脊髓縫隙連接蛋白43的表達情況及其對環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A通路、炎癥的影響▲

        2019-02-19 07:36:22馮鵬玖張愛民趙秀霞
        廣西醫(yī)學 2019年23期
        關鍵詞:骨癌嗎啡脊髓

        馮鵬玖 張愛民 蘇 明 蔡 海 趙秀霞 冉 婭

        (1 廣西柳州市中醫(yī)醫(yī)院麻醉科,柳州市 545000,電子郵箱:fpjlzzyy2018@163.com;2 廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院疼痛科,南寧市 530021)

        骨癌痛是惡性腫瘤發(fā)生骨轉(zhuǎn)移后出現(xiàn)的一種頑固性、復合型疼痛,常發(fā)生在乳腺癌、肺癌、前列腺癌的晚期[1]。以嗎啡為代表的阿片類藥物是控制癌痛的主要藥物,但隨著病情發(fā)展,常需不斷加大藥物劑量以滿足患者鎮(zhèn)痛需求[2],10%~20%骨癌痛患者的療效最終會變差,甚至無效,而這與嗎啡耐受密切相關[3],但導致骨癌痛嗎啡耐受(bone cancer pain-morphine tolerance,BPT)的機制仍未明確。既往研究表明,持續(xù)性癌痛可引起脊髓星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞進一步活化,白細胞介素(interleukin,IL)1β和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)α釋放增加,從而發(fā)生嗎啡耐受[4],因此,脊髓炎癥可能是導致BPT的重要原因。而環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)/蛋白激酶 A(protein kinase A,PKA)是調(diào)節(jié)脊髓炎性疼痛的重要信號通路[5]。還有研究結(jié)果顯示,縫隙連接蛋白43(connexin 43,Cx43)可介導非疼痛模型大鼠慢性嗎啡鎮(zhèn)痛耐受[6],這提示調(diào)控Cx43可能是逆轉(zhuǎn)BPT的重要方法。為此,本研究擬在前期研究[7]的基礎上,探討Cx43對BPT模型大鼠脊髓cAMP/PKA通路及炎癥的影響。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物 無特定病原體級SD雄性大鼠40只由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供(合格證號:SCXK桂~2014~0002),鼠齡4~6周,體重120~150 g 。

        1.2 主要材料、試劑及儀器 人鼻咽癌HONE1細胞由廣西醫(yī)科大學科學實驗中心提供。Von Frey纖維絲(美國Stoelting公司)。Cx43-小干擾核糖核酸(small interfering RNA,siRNA)序列及陰性對照-siRNA序列均參考文獻[8]設計,并由上海吉瑪基因公司合成,序列見表1。嗎啡注射液(東北制藥沈陽第一制藥,國藥準字:H21022436),一抗兔抗鼠Cx43(英國Abcam公司,批號:ab63851)、兔抗鼠cAMP(英國Abcam公司,批號:ab76238)、兔抗鼠PKA(α+β)(英國Abcam公司,批號:ab5815),酶標羊抗兔二抗(Abnova公司,批號:PAB9387),IL-1β和TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(中國碧云天公司,批號:PI303、PT516)。MK3型酶標儀(美國賽默飛儀器有限公司),Image Lab系統(tǒng)下成像儀(美國Bio-Rad公司),500 mA聯(lián)合X射線機(日立公司)。

        表1 Cx43-siRNA及陰性對照siRNA的序列

        1.3 動物分組與處理 本研究的動物實驗與分子生物學實驗部分均在廣西醫(yī)科大學進行,并經(jīng)廣西醫(yī)科大學動物學醫(yī)學科研倫理委員會審核備案(gxykd-倫-2018-095)。采用隨機數(shù)字表法將40只SD大鼠分為5組,每組8只,包括假手術(shù)組、骨癌痛組、BPT組、BPT+陰性對照-siRNA組(BPT-CS組)及BPT+Cx43-siRNA組(BPT-CXS組)。在實驗開始前,各組大鼠均在動物實驗中心飼養(yǎng)室內(nèi)適應喂養(yǎng)3 d,每日自由作息與飲食,光照晝夜各半,進行環(huán)境適應訓練。適應完成后,在無菌操作間內(nèi),取骨癌痛組、BPT組、BPT-CXS組、BPT-CS組大鼠,于左后肢脛骨上端穿刺后,骨髓腔內(nèi)注射接種已培養(yǎng)并鑒定的鼻咽癌HONE1 細胞2.4×106個(共30 μL),假手術(shù)組則在左后肢脛骨上端穿刺后骨髓腔內(nèi)注射等體積生理鹽水。 在機械刺激回縮閾值(mechanical withdraw threshold,MWT)顯著改變至穩(wěn)定時(降低至不再有統(tǒng)計學意義的閾值變化,約建模后7 d),聯(lián)合X射線拍片再次確定腫瘤生長,隨后BPT組、BPT-CXS組、BPT-CS組經(jīng)頸后皮下注射10 mg/(kg·次)的嗎啡注射液,而骨癌痛組皮下注射等體積的生理鹽水,2次/d,持續(xù)1周。在MWT出現(xiàn)顯著改變并穩(wěn)定(降低至不再有統(tǒng)計學意義的閾值變化,約建模后10 d)后,參照文獻[8]對BPT-CXS組、BPT組、 BPT-CS組大鼠進行硬膜外置管并建立皮下隧道后固定于頸后方,然后BPT-CXS組鞘內(nèi)注射Cx43-siRNA(2 μg/10 μL),而BPT-CS組則鞘內(nèi)注射陰性對照-siRNA(2 μg/10 μL),BPT組則鞘內(nèi)注射等體積的生理鹽水,2次/d,連續(xù)3 d。siRNA干預后9 d(MWT出現(xiàn)顯著改變并穩(wěn)定),使用10%水合氯醛(劑量為:0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉處死各組大鼠后,迅速取出脊髓L4~L6節(jié)段,液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存,用于相關指標的檢測。

        1.4 MWT的檢測方法 參考文獻[9],使用Von Frey纖維絲up-and-down法檢測各組大鼠的機械痛閾值。測量前大鼠均處于安靜狀態(tài),測量的最小值為0.07 g,最大值為15 g,首先選擇2.0 g纖維絲垂直刺激安靜狀態(tài)下的大鼠右側(cè)后爪內(nèi)側(cè)皮膚,逐漸增加力度使纖維絲彎曲成角,持續(xù)1.5 s,連續(xù)檢測3次,間隔5 min后重復檢測,以嘶吼、添足、甩尾及彈腿等任一行為發(fā)生陽性表現(xiàn),然后選擇低于此力度的纖維絲繼續(xù)刺激,直至刺激出陰性表現(xiàn)為止;若為陰性表現(xiàn)則使用大于此力度的纖維絲直至出現(xiàn)陽性表現(xiàn)。以出現(xiàn)陽性體征的最低力度為MWT,MWT越低,疼痛程度越高。

        1.5 Cx43及cAMP、PKA蛋白的檢測 取出各組標本,加入蛋白酶抑制劑的組織裂解液RIP,在冰浴中超聲勻漿,12 000 r/min離心30 min后取上清液,采用二喹啉甲酸標準蛋白測定法檢測總蛋白濃度,取40 μg總蛋白進行20%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,恒電壓100 V、2 h條件下將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜,脫脂奶粉封閉2 h,TBST漂洗干凈后加入Cx43、cAMP、PKA(α+β)一抗(稀釋度分別為1 ∶1 000、1 ∶2 500、1 ∶200),4℃搖床孵育過夜,TBST洗膜3次,加入酶標二抗,37℃孵育2 h。TBST漂洗干凈后,在Image Lab系統(tǒng)下進行條帶掃描成像,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參,分別以Cx43/GAPDH、cAMP/GAPDH、PKA/GAPDH條帶灰度值比值為目的蛋白相對表達量。

        1.6 IL-1β和TNF-α水平的檢測 從冰箱取出脊髓L4~L6節(jié)段標本,冰浴環(huán)境下行超聲勻漿,離心10 min(4℃、2 000 g)后分別提取上清液,按照酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說明書檢測IL-1、TNF-α水平。

        1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示,比較采用單因素分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗;重復測量資料比較采用重復測量方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 不同時間點5組大鼠MWT比較 骨癌痛建模后7 d大鼠MWT出現(xiàn)顯著變化,建立BPT模型;建立BPT模型后10 d大鼠MWT出現(xiàn)顯著變化,給予siRNA干預。不同組的MWT差異有統(tǒng)計學意義(F組間=152.744,P組間<0.001),不同時間點間的MWT差異有統(tǒng)計學意義(F時間=834.561,P時間<0.001),分組與時間無交互效應(F交互=3.475,P交互=0.067)。其中,在建立BPT模型當天(骨癌痛建模后7 d),與假手術(shù)組比較,其余4組的MWT均下降(均P<0.05);在建立BPT模型后1~8 d,與骨癌痛組比較,BPT-CXS組、BPT組、 BPT-CS組的MWT均增加(均P<0.05),但BPT-CXS組、BPT組、 BPT-CS組組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);在建立BPT模型后9 d至siRNA干預后9 d,與骨癌痛組比較,BPT-CXS組、BPT組、 BPT-CS組MWT均降低(均P<0.05),BPT組和BPT-CS組組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);在siRNA干預后6~9 d,BPT-CXS組的MWT低于骨癌痛組,而高于BPT組和BPT-CS組(均P<0.05)。見表2。

        表2 5組各時間點MWT比較(x±s,g)

        2.2 5組大鼠脊髓組織Cx43及cAMP、PKA蛋白相對表達量比較 與假手術(shù)組比較,其余4組的Cx43、cAMP、PKA蛋白相對表達水平均升高(均P<0.05);與骨癌痛組比較,BPT組、BPT-CS組和BPT-CXS組的Cx43及cAMP、PKA蛋白相對表達水平均升高(均P<0.05);與BPT組比較,BPT-CXS組的Cx43及cAMP、PKA蛋白相對表達水平均降低(均P<0.05);而BPT-CS組與BPT組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3及圖1。

        表3 5組大鼠脊髓組織Cx43、cAMP、PKA蛋白的相對表達水平(x±s)

        注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與骨癌痛組比較,△P<0.05;與BPT組比較,▲P<0.05。

        圖1 5組大鼠脊髓組織Cx43、cAMP、PKA 蛋白表達情況

        注:A、B、C、D、E分別代表假手術(shù)組、骨癌痛組、BPT-CXS組、BPT組、BPT-CS組。

        2.3 5組大鼠脊髓組織TNF-α和IL-1β水平比較 與假手術(shù)組比較,其余4組的TNF-α、IL-1β水平增加(均P<0.05);與骨癌痛組比較,BPT組、BPT-CS組和BPT-CXS組的TNF-α、IL-1β水平均增加(均P<0.05);與BPT組比較,BPT-CXS組的TNF-α、IL-1β水平均降低(均P<0.05),而BPT-CS組與BPT組組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

        表4 5組大鼠脊髓組織TNF-α和IL-1β水平比較(x±s,pg/mg)

        注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與骨癌痛組比較,△P<0.05;與BPT組比較,▲P<0.05。

        3 討 論

        骨癌痛是復雜性疼痛,包括炎性疼痛、傷害性疼痛與神經(jīng)病理性疼痛等多種性質(zhì)疼痛。本研究結(jié)果顯示,骨癌痛大鼠建模后7 d,其他4組大鼠的MWT均低于假手術(shù)組(均P<0.05),提示通過骨髓腔內(nèi)注射接種鼻咽癌HONE1細胞成功建立了骨癌痛模型;隨即給予BPT組、BPT-CXS組、BPT-CS組大鼠皮下注射嗎啡,在建立BPT模型后9 d起,BPT-CXS組、BPT組、BPT-CS組大鼠的MWT均低于骨癌痛組(均P<0.05),出現(xiàn)嗎啡耐受;在siRNA干預后6~9 d,BPT-CXS組的MWT低于骨癌痛組,但高于BPT組和BPT-CS組(均P<0.05),而BPT組和BPT-CS組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),這提示鞘內(nèi)使用Cx43-siRNA,可以緩解嗎啡耐受現(xiàn)象。

        既往研究表明,脊髓背角趨化因子受體CXCR4通過活化c-fos參與了骨癌痛大鼠嗎啡耐受的形成[10],而上調(diào)CXCR4的表達后可以進一步激活衛(wèi)星膠質(zhì)細胞參與炎性疼痛[11]。因此,通過調(diào)控脊髓炎癥可能是改善骨癌痛嗎啡耐受的途徑。Cx43作為神經(jīng)細胞連接蛋白之一,參與細胞間的信號轉(zhuǎn)導。研究表明,脊髓Cx43蛋白參與慢性神經(jīng)病理性疼痛的維持[12],尤其在星狀膠質(zhì)細胞中,Cx43蛋白的高表達促進脊髓的炎性因子釋放[13]。沈?qū)幍萚6]研究發(fā)現(xiàn),脊髓Cx43通過c-Jun氨基末端激酶通路參與了嗎啡的耐受。盡管該作者未使用骨癌痛模型進行研究,但所得結(jié)果亦提示Cx43在嗎啡耐受的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。本研究結(jié)果顯示,骨癌痛組的Cx43蛋白相對表達水平高于假手術(shù)組,且BPT組的Cx43蛋白相對表達水平高于骨癌痛組(均P<0.05)。這提示脊髓Cx43蛋白不僅參與神經(jīng)病理性疼痛,脊髓組織Cx43蛋白高表達可能也是骨癌痛及BPT發(fā)生的重要機制。

        cAMP/PKA是細胞經(jīng)典的途徑,細胞外信號后使cAMP濃度增加,進一步上調(diào)PKA,可直接或間接調(diào)節(jié)細胞代謝。Cx43蛋白是細胞膜上重要的受體蛋白,Cx43可通過cAMP/PKA通路產(chǎn)生縮血管反應[14],破壞細胞膜的完整性[15],這提示Cx43傳遞的信號可被cAMP/PKA通路接收。本研究中,骨癌痛組的cAMP、PKA蛋白相對表達水平高于假手術(shù)組,且BPT組的cAMP、PKA蛋白相對表達水平高于骨癌痛組(均P<0.05),即骨癌痛發(fā)生后脊髓組織中Cx43蛋白的高表達伴隨 cAMP/PKA通路的激活,而發(fā)生嗎啡耐受后,cAMP/PKA通路隨著Cx43蛋白表達的升高而進一步被激活;與BPT組比較,BPT-CXS組的Cx43及cAMP、PKA蛋白相對表達水平均降低(均P<0.05),即抑制Cx43表達后嗎啡耐受得以緩解的同時,cAMP/PKA蛋白表達亦降低,這提示Cx43-cAMP/PKA通路可能在BPT發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

        脊髓星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞激活后大量釋放入組織[16],作用于神經(jīng)元細胞膜,產(chǎn)生細胞毒性作用。值得注意的是,在神經(jīng)系統(tǒng)中,cAMP激活后可促進小膠質(zhì)細胞釋放IL-1β和TNF-α等炎性因子[17],且嗎啡耐受時,也可導致炎性因子的增加[18]。在本研究中,骨癌痛組脊髓IL-1β和TNF-α水平高于假手術(shù)組,且BPT組的脊髓IL-1β和TNF-α水平高于骨癌痛組(均P<0.05),而BPT-CXS組脊髓IL-1β和TNF-α水平低于BPT組(均P<0.05),即脊髓cAMP/PKA的激活與抑制,均伴隨IL-1β和TNF-α濃度的增加與降低,推測在骨癌痛及BPT的大鼠模型中,脊髓IL-1β和TNFα等炎性因子可能是調(diào)控cAMP/PKA通路的重要代謝蛋白之一。

        綜上所述,脊髓Cx43通過調(diào)節(jié)cAMP/PKA通路進而釋放促炎性因子IL-1β和TNF-α,可能是BPT發(fā)生的關鍵機制之一,而抑制脊髓Cx43表達可能是逆轉(zhuǎn)BPT現(xiàn)象的重要途徑。

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