洪春永 林進皇 林慶金 李清金 韓玉惠 江 華 吳欣宇 盧武生

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇九醫(yī)院暨廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建省漳州市 363000，電子郵箱：1401845754@qq.com)

缺血性腦卒中通常是指因腦的供血動脈(頸動脈或椎動脈系統(tǒng))狹窄或閉塞引起血液循環(huán)障礙、缺血、缺氧所致的局部腦組織缺血性壞死的總稱，發(fā)病后2周內(nèi)定義為急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)。AIS是腦卒中最常見的類型，占腦卒中的69.6%～70.8%[1]。由于AIS具有高致死性、高致殘率、預(yù)后不佳的特點，早期AIS的血液學(xué)標(biāo)志物對其早診斷、早治療、早康復(fù)和預(yù)防再發(fā)具有重要的臨床意義和應(yīng)用價值[1-2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，參與多種病理生理機制，例如腦缺血損傷、神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)生長發(fā)育等，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能中起重要作用。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白2A/可變讀框基因內(nèi)含子2(cycling-dependent kinase inhibitor 2A/alternative reading frame Intron 2,CAI2)長鏈非編碼RNA位于9號染色體，是單外顯子、多腺苷酸化基因，對9p21的兩個重要抑癌基因p16、可變讀框基因有調(diào)控作用[3]。有關(guān)LncRNA CAI2在AIS中作用機制的研究鮮見報告。 本研究檢測AIS患者血清中LncRNA CAI2的表達水平及其在AIS中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年1月至2018年10月在我科治療的26例AIS患者(AIS組)的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[1]中關(guān)于AIS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭顱CT和(或)MRI證實；(2)均為首次急性發(fā)病，發(fā)病至就診時間在24 h內(nèi)，病程為2～14 d。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)機體存在感染灶或入院前1周內(nèi)有感染史；(2)嚴(yán)重肝腎功能不全；(3)合并腦出血；(4)心臟瓣膜病、心房顫動等導(dǎo)致的心源性栓塞；(5)腔隙性腦梗死。另選取同期在我院門診體檢的26名健康者作為對照組。其中AIS組男性14例，女性12例；年齡50～67(55.0±6.7)歲，對照組男性14例，女性12例；年齡 49～66(54.0±5.7)歲。兩組研究對象的性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究符合本院倫理委員會要求，研究對象均知情同意。

1.2 方法 取AIS患者發(fā)病48 h內(nèi)、對照組體檢當(dāng)日的靜脈血3 mL，枸櫞酸鈉抗凝，5 000 r/min離心20 min取血清，置于-80℃液氮中保存待測。提取總RNA后，采用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)法測定血清LncRNA CAI2水平，具體步驟：(1)采用High Capacity cDNA reverse transcription kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems,USA，批號：A257414368813)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μL 200 ng/μL RNA、2.0 μL 10×RT Buffer、0.8 μL 25×dNTP Mix(100 mM)、2.0 μL 10×RT隨機引物、1.0 μL MultiScribeTM逆轉(zhuǎn)錄酶、4.2 μL不含核酸酶H2O；反應(yīng)條件為25℃，10 min;37℃,120 min;85℃,5 min。(2)采用PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑(Applied Biosystems,USA，批號：A25741)對cDNA進行擴增，反應(yīng)體系為10 μL，包括5 μL PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(2×)，0.5 μL上游引物(500 nM)、0.5 μL下游引物(500 nM)、4 μL cDNA+不含核酸酶H2O。反應(yīng)條件為95℃ 2 min，95℃ 15 s(40個循環(huán))，60℃ 30 s。采用CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(BIO-RAD公司，USA)進行實時定量PCR，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，引物序列見表1。PCR擴增完成后，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△CT法，計數(shù)LncRNA CAI2的相對表達量。

表1 引物序列

以AIS患者LncRNA CAI2表達水平的中位數(shù)為基準(zhǔn)將AIS患者分為LncRNA CAI2低表達組和高表達組。以梗死灶CT表現(xiàn)(病灶大小和個數(shù))作為分型標(biāo)準(zhǔn)[4]，將腦梗死分為大梗死、中梗死、小梗死、腔隙性梗死、多發(fā)性梗死。根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(the National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)的評分標(biāo)準(zhǔn)，將梗死程度分為輕、中、重度[5-7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，比較采用確切概率法；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線評估LncRNA CAI2表達水平診斷AIS的敏感度和特異度。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組研究對象血清LncRNA CAI2表達水平比較 AIS組LncRNA CAI2表達水平為(1.505±0.050)，對照組為(1.147±0.054)，AIS組LncRNA CAI2表達水平高于對照組(t=24.805，P<0.001)。

2.2 AIS患者血清LncRNA CAI2表達水平與臨床特征的關(guān)系 LncRNA CAI2表達水平與梗死程度相關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡、梗死分型、高血壓、吸煙史、血糖水平未見相關(guān)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表2。

表2 AIS患者血清LncRNACAI2表達水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

2.3 血清LncRNA CAI2水平對AIS的診斷價值 ROC結(jié)果顯示，血清LncRNA CAI2水平診斷AIS的曲線下面積為0.826，95%CI為0.716～0.936；最佳截斷值為0.500時，其敏感度為65.4%，特異度為84.6%，見圖1。

圖1 血清LncRNA CAI2診斷AIS的ROC曲線

3 討 論

AIS是臨床最常見的腦血管疾病之一，常伴隨著神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷[8-9]。AIS具體病因未明，發(fā)病機制復(fù)雜，嚴(yán)重威脅中老年人身心健康。近年來，AIS患病率呈逐年上升的趨勢,且致殘率和致死率均較高[10-11]，給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。

LncRNA在腦組織中廣泛表達，在腦缺血和卒中康復(fù)中具有重要作用，可通過神經(jīng)興奮毒性、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、凋亡等病理機制引起AIS患者大腦二次損傷，阻礙患者神經(jīng)功能康復(fù)，但具體機制尚未完全清楚[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，AIS患者LncRNA ANRIL表達下調(diào)與腦卒中風(fēng)險、疾病嚴(yán)重程度、炎癥反應(yīng)成正相關(guān)[14]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，linc-DHFRL1-4、SNHG15、linc-FAM98A-3等LncRNA在AIS患者中的表達水平高于健康人和短暫性腦缺血發(fā)作患者，某些LncRNA如SNHG15、linc-FAM98A-3可作為診斷AIS的標(biāo)志物[15]。CAI2在正常組織中低表達，在多種腫瘤細(xì)胞均有高表達[3]，但其在AIS中的作用鮮見報道。本研究結(jié)果顯示，AIS組患者LncRNA CAI2表達水平高于對照組，且其表達水平與梗死程度相關(guān)(均P<0.05)，提示AIS患者血清LncRNA CAI2表達水平升高，LncRNA CAI2與患者疾病的嚴(yán)重程度有一定相關(guān)性，可能參與AIS的發(fā)展。

本研究ROC結(jié)果顯示，血清LncRNA CAI2水平診斷AIS的曲線下面積為0.826，95%CI為0.716～0.936；當(dāng)取臨界值為0.500時，其敏感度為65.4%，特異度為84.6%。這提示血清LncRNA CAI2的表達水平對于 AIS 的診斷具有一定的指導(dǎo)價值。但目前關(guān)于LncRNA的研究仍處于起步階段，其相關(guān)的分子機制未闡明，而且很多LncRNA只在靈長類動物中表達，這給LncRNA的研究帶來一定困難。

綜上所述，AIS患者血清LncRNA CAI2水平升高，其或可成為早期診斷AIS的一種潛在生物學(xué)標(biāo)志物。但本研究樣本例數(shù)較少，且為回顧性研究，可能存在一定的偏倚，相關(guān)結(jié)果有待更多前瞻性、大樣本的隨機臨床試驗來驗證。