殷悅，徐宇，唐劉秀，陸全平，許志強

（江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）俗稱河蟹，是我國最重要的淡水養(yǎng)殖品種之一。性早熟是當前影響河蟹養(yǎng)殖效益的瓶頸問題之一，性早熟幼蟹在培育過程中性腺當年發(fā)育成熟，不能繼續(xù)順利蛻殼，體質量增長緩慢甚至停滯，絕大多數在第2年4—5月期間死亡，不能再繼續(xù)飼養(yǎng)至2齡成蟹規(guī)格[1]。此外，由于性早熟一齡蟹的大量存在，在蟹種培育階段還導致了飼料的巨大浪費，嚴重影響了河蟹養(yǎng)殖效益。河蟹養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)，即使在相同的外在環(huán)境條件下，也只有部分個體發(fā)生性早熟。這一現(xiàn)象表明，除了外部環(huán)境因素外，個體內在的遺傳因素同樣會影響河蟹性早熟的發(fā)生[2-4]。甲殼動物眼柄內的X-器官-竇腺復合體是其神經內分泌的主要調控中心，與蛻皮、生殖以及血糖代謝等生理功能密切相關[5]。目前，在河蟹以外的多種甲殼動物的X-器官-竇腺復合體中已分離和鑒定出了高血糖激素家族激素（主要有GIH、MIH、CHH和MOIH等）以及促色素細胞激素家族激素（主要有RPCH和PDH等）等多種神經肽類激素，這些激素均以顆粒的形式在竇腺中儲存和釋放，調控著甲殼動物的蛻皮、生殖、血糖代謝及其對環(huán)境的適應等生理功能。蛻皮抑制激素基因（MIH）是由眼柄的神經內分泌細胞分泌的一種多肽神經激素，MIH不僅在協(xié)調蛻殼方面發(fā)揮了內分泌調節(jié)器的作用，而且在卵黃生成過程中也發(fā)揮著重要的生物學功能[6-10]。

該研究以河蟹蛻皮抑制激素基因（MIH）編碼區(qū)序列上的SNPs為研究目標，采用PCR產物直接測序和PCR-RFLP技術相結合的方法對蟹種群體（正常群體及性早熟群體）進行基因分型，發(fā)現(xiàn)位于MIH基因內含子區(qū)一個SNP位點（SNPg.2466 C＞T）與中華絨螯蟹的性早熟之間存在較具統(tǒng)計學意義的相關性（OR=0.459，95%CI 0.223～0.944，P=0.034），該研究可為后續(xù)選育低性早熟河蟹新品種提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

蟹種培育在江蘇省淡水水產研究所江浦基地進行，每667 m2放養(yǎng)1.5 kg大眼幼體，采用江蘇地區(qū)常規(guī)養(yǎng)殖方式進行蟹種培育。翌年3月從同一養(yǎng)殖池塘內隨機采集性早熟蟹和正常扣蟹樣本各100只以上（雌雄各半），樣品活體運輸至實驗室后取附肢肌肉于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因分型

1.2.1 SNPs所在序列的PCR擴增 隨機挑選30只蟹種并提取每個樣本的基因組DNA，根據中華絨螯蟹MIH基因序列信息（AY310313）設計引物擴增外顯子區(qū)和內含子區(qū)（3個外顯子及2個內含子），采用PCR產物直接測序篩選區(qū)段的SNP位點（引物未列出）。根據得到的SNPs信息，分別設計引物擴增包含不同SNP位點的序列片段（表1）。PCR反應體系為 25 μL（Vazyme Biotech Co.,Ltd），其中包括 2×Taq Master Mix 12.5 μL，dNTP（2.5 mM）1 μL，正反向引物（10μM）各1μL，ddH2O補足體積至25μL。PCR反應共計30個循環(huán)，循環(huán)前94℃預變性5 min，每個循環(huán)包括94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)結束后于72℃延伸5 min。擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后于-20℃保存，用于后續(xù)酶切反應。

1.2.2 基因分型 內含子區(qū)2的SNPs分布較為集中，采用PCR產物直接測序法對該區(qū)域內的6個SNPs進行基因分型，采用PCR-RFLP對剩余SNPs進行基因分型。PCR產物酶切過夜后用3%瓊脂糖凝膠電泳進行分離以確定每個樣本的基因型，隨機挑選個體采用PCR產物直接測序法對基因分型結果作進一步驗證。

表1 中華絨螯蟹MIH基因編碼區(qū)SNPs基因分型所用引物及限制性內切酶

1.3 統(tǒng)計分析

對性早熟和正常發(fā)育蟹種群體進行單個位點的性狀-基因型關聯(lián)分析（基于共顯性模型和相加模型的Logistic回歸分析），并計算相對應的相應P值及比值比（Odds Ratio,OR）及其95%可信區(qū)間（confidence interval,CI），篩查與中華絨螯蟹性早熟性狀具有統(tǒng)計學意義相關性的SNP位點。

2 結果與分析

對隨機選擇的30個正常蟹種的MIH基因（外顯子區(qū)及內含子區(qū)）進行SNPs篩查，共鑒定出10個SNPs（表1）。其中，外顯子區(qū)共檢測到3個SNPs（SNP g.422 C＞T，SNP g.1714 A＞C，SNP g.2529 C＞T），內含子區(qū)共檢測到7個SNPs（SNP g.2384 C＞A，SNP g.2387 A＞G，SNP g.2410 C＞A，SNP g.2415 T＞C，SNP g.2416 T＞C，SNP g.2430 T＞C，SNP g.2466 C＞T）。

對10個SNP位點在所有樣本中的基因型分布情況進行基因分型，各個SNP位點不同基因型個體的數量以及不同基因型個體間的差異統(tǒng)計學意義分析結果見表2。性狀-基因型關聯(lián)分析結果顯示：位于MIH基因內含子2的一個SNP位點（SNP g.2466 C＞T）與河蟹性早熟之間存在著具統(tǒng)計學意義的相關性（OR=0.459,95%CI 0.223～0.944,P=0.034）。SNP g.2466 C＞T的PCR-RFLP基因分型圖譜以及PCR產物直接測序驗證圖譜見圖1。

3 討論

MIH作為甲殼動物高血糖激素（CHH）家族的一員，是一種由XO-SG中的神經內分泌細胞分泌的多肽神經激素，它對甲殼動物的生長發(fā)育起著至關重要的作用。由于不正常的蛻皮現(xiàn)象在性早熟河蟹中廣泛存在，因此可以推測MIH基因變異可能與中華絨螯蟹的性早熟有關。之前的有關研究發(fā)現(xiàn)，在多數甲殼動物中，MIH基因的變異被認為是影響生長和繁殖性能的主要內在因素[11-12]。目前，已有研究者從一些甲殼動物如中華絨螯蟹（Eriocheir sinenis）、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）和南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）的MIH基因中鑒定篩選出SNPs位點[13-14]。該試驗室在中華絨螯蟹MIH基因中發(fā)現(xiàn)了一個與性早熟具統(tǒng)計學意義相關的SNP。Li等[15]在南美白對蝦MIH基因中發(fā)現(xiàn)了一個與生長性狀具統(tǒng)計學意義相關的SNPs A＞G 171。

表2 中華絨螯蟹MIH基因編碼區(qū)10個SNPs的基本信息及其在性早熟與正常河蟹群體中的分布情況

表3 SNPg.2466 C＞T與中華絨螯蟹性早熟的關聯(lián)性分析

圖1 SNPg.2466 C＞T PCR-RFLP基因分型及測序驗證注：（A）SNP C2466C 基因型模式（3%瓊脂糖凝膠電泳）：CT（泳道 2），CT（泳道 3），CC（泳道 4）和 TT（泳道 5）。（B）MIH SNP C2466C基因型的測序驗證結果。

近年來，已有許多國內外學者開始關注SNP變異與水產動物重要經濟性狀之間的相關性研究。Li X等從加州鱸（Micropterus salmoides）的IGF-Ⅱ基因中共鑒定出4個SNPs，發(fā)現(xiàn)特定的SNP單倍型（CTCC/CGCC和CTCC/TTTT））與加州鱸生長性狀之間存在著具統(tǒng)計學意義的相關性（P＜0.05）[16]。Wang GL.等從三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）的 SOD3基因中鑒定出了18個SNPs，發(fā)現(xiàn)有2個SNP變異（g.7994C＞G和g.8087G＞C）與三角帆蚌對嗜水氣單胞菌的抗性性狀之間存在具統(tǒng)計學意義的相關性 （P＜0.05）[17]。Fu GH 等從亞洲鱸魚（Asian seabass）的LECT2基因上發(fā)現(xiàn)了3個SNPs，但是未發(fā)現(xiàn)這些SNPs與Big belly disease疾病抗性之間存在具統(tǒng)計學意義的相關性[18]。目前，與其他水產物種相比，國內外關于河蟹遺傳變異與某些重要生物學性狀之間的相關性研究較少。該研究發(fā)現(xiàn)位于MIH基因內含子區(qū)一個SNP位點（SNPg.2466 C＞T）與中華絨螯蟹的性早熟之間存在具統(tǒng)計學意義的相關性（OR=0.459,95%CI 0.223～0.944,P=0.034）。在以低性早熟為選育指標的河蟹遺傳育種研究過程中，通過對河蟹育種群體進行SNP g.2466 C＞T基因分型，結合形態(tài)學特征分析，可以優(yōu)先選擇基因型為TT的個體作為育種親本，該研究對于后續(xù)選育大規(guī)格河蟹新品種具有重要的指導意義。