趙文超，王敬晗，祝建勇，趙錦標，安 陽，李景波，邱寶安，夏念信

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC；簡稱肝癌)在世界范圍內(nèi)是發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一，在我國亦是如此。目前認為HCC發(fā)生主要與乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)和丙肝病毒(hepatitis C virus,HCV)感染相關(guān)[1]。但非肝炎病毒性肝癌(多數(shù)為非乙肝丙肝相關(guān)性肝癌，non-B non-C HCC,NBNC-HCC)也占相當比例，且更容易被忽視。NBNC-HCC患者的背景肝病多與代謝性疾病相關(guān)，主要包括非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)，其他包括酒精性脂肪性肝病、肥胖、糖尿病等[2]。近期有來自日本的統(tǒng)計研究發(fā)現(xiàn)，在肝炎病毒流行得以逐步控制的今天，NBNC-HCC的發(fā)生率有逐步增加的趨勢[3]，其相關(guān)危險因素、預后結(jié)果等尚存爭議。原因在于對于此類肝癌患者的臨床特點和與常見肝炎病毒相關(guān)性肝癌的發(fā)病機理之間缺乏對比研究[4]。對NBNC-HCC在生物學行為、分子機制領(lǐng)域的探討，有助于改變我們對此類肝癌患者的認識，并改善其預后。

人含DEP結(jié)構(gòu)域1(DEP domain containing 1，DEPDC1)基因位于染色體1p31.2，全長約23 Kb，其表達產(chǎn)物與細胞膜錨定、信號轉(zhuǎn)導、細胞極性確立、小分子GTP酶活性密切相關(guān)[5]。有研究表明在膀胱癌中，下調(diào)DEPDC1的表達可明顯抑制腫瘤細胞生長[6]。同時還有研究顯示乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展與DEPDC1相關(guān)[7]。目前DEPDC1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用報道較少，且多集中于肝炎、肝硬化背景下的肝癌，尚未有在NBNC-HCC中的比較研究。本研究收集了大量NBNC-HCC臨床樣本，旨在初步評估DEPDC1基因表達與NBNC-HCC的發(fā)生及預后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2007年6月—2014年6月間解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心肝膽外科手術(shù)切除、經(jīng)病理切片證實的56例NBNC-HCC冰凍組織和石蠟標本(同時每例患者另取距癌組織2～5 cm處的癌旁組織標本作為對照)，并搜集患者的臨床病例資料。其中男32例，女24例，中位年齡48(21～67)歲?；颊唠S訪64個月，中位生存時間45個月。同時對56例肝癌組織及其癌旁組織抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行轉(zhuǎn)錄水平的分析。

1.2 主要抗體及試劑 實時定量PCR所用熒光標記物SYBR Green Mix購自廣州東盛生物科技有限公司；兔抗人DEPDC1pAb抗體(HRP標記的羊抗兔二抗購自英國Ahmar公司)。TRIzol reagent購自美國Invitrogen公司；甲醇、無水乙醇均購自上海試劑一廠；Annexin V-硫氰酸熒光素凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。DEPDC1引物序列上游:5′-CACTGGGTATTA TCTGCCATGAAG3′；下游：5′-AATCTGCGATTGTI CTGAATACATO-3′，擴增產(chǎn)物為112 bp。GAPDH引物序列上游：5′-GGGTGTGAACCATGAGAAGTATO 3′；下游:5′-GATGGCATGGACTGTGGTCAT 3′，擴增產(chǎn)物為154 bp，由美國Invitrogen公司合成。

1.3 免疫組織化學染色法檢測DEPDC1蛋白的表達 將所有肝癌及其癌旁組織進行4 mm連續(xù)切片，石蠟包埋，應用cyclin G1多抗進行免疫組化SP法染色。具體操作步驟：①石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min，以清除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；②抗原微波熱修復3 min，抗原修復液為pH6.0檸檬酸緩沖液；③3.5%～10%正常山羊血清封閉非特異性位點，室溫孵育10 min；④傾去血清，滴加cyclin GI-抗工作液37 ℃孵育過夜；⑤滴加生物素標記的二抗工作液，濕盒中孵育20 min;⑥滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作液，濕盒中孵育20 min。上述步驟之間均用0.01 mmol/L PBS(pH=7.4)沖洗。二氨基聯(lián)苯胺染色，自來水沖洗、蘇木精復染細胞核、封片。結(jié)果判定：細胞質(zhì)或細胞膜呈清晰黃褐色顆粒為陽性表達，高倍鏡(×400)下隨機觀察5個視野，根據(jù)陽性細胞百分率和染色強度進行半定量分析，染色強度：無染色0分，輕度染色計1分，中度染色計2分，強染色3分；陽性細胞數(shù)<10%計0分,10%～25%計1分，26%～50%計2分，>50%計3分。2項指標評分相乘，0～1分為陰性病例(-)，≥2分為陽性病例(+)，≥4分為強陽性病例(++)。由2名病理科醫(yī)師雙盲法計數(shù)，差異超過10%需重新計數(shù)。

1.4 實時定量PCR檢測肝癌組織及癌旁組織中DEPDC1 mRNA的表達 將收集的肝癌及癌旁組織碾碎，分別置于1.5 mL EP管中，Trizol reagent收集組織，根據(jù)試劑盒說明的步驟進行RNA的抽提，然后進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA用于實時定量PCR檢測。PCR擴增條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃延伸30 s，39個循環(huán)，72～95 ℃溶解曲線分析5 s。以雙Ct值法計算靶基因相對表達水平：DEPDC1相對表達水平=(ΔCt)；ΔCt=Ct(DEPDC1)-Ct(GAPDH)；Δ(ΔCt)=ΔCtΔCt(Control)。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料的均數(shù)比較采用t檢驗，計數(shù)資料的生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比較采用log-rank檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DEPDC1蛋白在肝癌組織與癌旁組織中的表達水平 首先免疫組織化學染色法檢測了56例NBNC-HCC及其癌旁組織中DEPDC1蛋白的表達情況，免疫組化染色(圖1)所示，陽性染色主要位于胞漿內(nèi)，呈棕黃色或褐色，56例肝癌組織DEPDC1染色均呈陽性著色，且肝癌組織中的表達(7.83±0.17)顯著高于癌旁組織(4.67±0.22)，差異比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 DEPDC1 mRNA在肝癌組織與癌旁組織中的表達水平 實時定量PCR檢測56例手術(shù)切除的NBNC-HCC組織及其癌旁組織中DEPDC1 mRNA的表達，研究結(jié)果(圖2)顯示，DEPDC1 mRNA在41例肝癌組織中的表達高于癌旁組織中的表達，高表達率為73.2%(41/56)。研究提示DEPDC1基因在大多數(shù)肝癌組織中表達高于癌旁組織，DEPDC1基因有可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。

圖1 免疫組化染色法檢測DEPDC1蛋白在肝癌組織及癌旁組織中的表達(sp×100)

圖2 DEPDC1 mRNA在肝癌組織及癌旁組織中的表達

2.3 DEPDC1的表達與NBNC-HCC臨床病例特征的相關(guān)性 整理入組的56例NBNC-HCC患者相關(guān)臨床病例資料，結(jié)合DEPDC1免疫組織化學染色和評分情況行統(tǒng)計學分析，以肝癌組織中DEPDC1表達評分的中位數(shù)為界值，高于此界值定義為DEPDC1高表達組，低于此界值定義為DEPDC1低表達組。DEPDC1高、低表達組的患者臨床特征見表1。肝癌患者在DEPDC1高表達組，其腫瘤分化程度較低表達組低；TNM分級較低表達組晚；甲胎蛋白DEPDC1高表達組明顯高于低表達組，差異比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；同時DEPDC1高表達組的微血管癌栓發(fā)生率為69.7%，較低表達組34.5%明顯增高，差異比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。DEPDC1表達與肝癌患者年齡、性別、腫瘤大小未見明顯關(guān)聯(lián)(P>0.05)。

2.4 DEPDC1的表達與NBNC-HCC預后的相關(guān)性 56例NBNC-HCC患者進行預后隨訪，整理預后信息，在肝癌組織中DEPDC1的高、低表達可較好地預測肝癌患者的預后情況。DEPDC1高表達組患者預后較差(中位總體生存期為42個月)，而DEPDC1低表達組患者預后較好(中位總體生存期為56個月)，DEPDC1低表達組與高表達組相比，其總體生存期差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，圖3)。

表1 DEPDC1表達程度與腫瘤臨床病例數(shù)據(jù)之間的關(guān)系

圖3 總體生存期曲線

3 討論

近年來流行病學研究顯示，隨著抗肝炎病毒藥物的不斷發(fā)展，病毒相關(guān)性肝癌的發(fā)病率則呈現(xiàn)逐步降低的趨勢。相反，NBNC-HCC的發(fā)病率逐步升高，占所有肝癌病例的6.8%～17.3%[2]。可以預見NBNC-HCC的治療將逐步得到重視。由于既往NBNC-HCC在所有肝癌患者中僅占據(jù)較少部分，且由于其背景疾病涉及范圍較廣，包括酒精性肝病、NAFLD、代謝性疾病(糖尿病、高脂血癥、含鐵血黃素沉積癥)等[2]，導致其相關(guān)臨床特點較復雜，研究較少。其與肝炎相關(guān)性肝細胞癌在分子機制、細胞通路方面的異同，也缺乏比較研究。

目前，手術(shù)切除仍然是治療肝細胞癌的最有效手段。然而，由于肝癌起病較隱匿，大多數(shù)患者確診時已無法手術(shù)切除。由于NBNC-HCC患者背景肝病發(fā)病率較高，難以得到重視，早期發(fā)現(xiàn)的概率較低，因此有部分研究提示NBNC-HCC患者手術(shù)切除率比肝炎病毒相關(guān)性肝癌患者低[8]。對于接受手術(shù)的患者，術(shù)后腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是影響手術(shù)效果的首要原因，手術(shù)僅僅是治療的一環(huán)，多學科、多手段綜合治療逐步成為主流?；谏鲜霈F(xiàn)狀，研究NBNC-HCC發(fā)生發(fā)展過程中的基因變化，篩選藥物治療的靶點，有著重要的臨床意義。

DEPDC1基因編碼一種高度保守的蛋白，大小約92 kDa。該蛋白作用廣泛，涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞有絲分裂以及凋亡。其在膀胱癌、前列腺癌、多發(fā)骨髓瘤、膠質(zhì)瘤中均有過表達的報道[9-10]，提示此蛋白在腫瘤的發(fā)展過程中起到了重要作用。有研究提示，DEPDC1蛋白在微管為靶標的化療過程中，能夠通過JNK依賴的途徑，促使BCL-2家族抗凋亡MCL-1蛋白下調(diào)，抑制細胞凋亡[11]。膀胱癌中DEPDC1和ZNF-224基因可共同促進NF-κB信號通路表達[12]；另有研究表明，DEPDC1蛋白在調(diào)節(jié)前列腺癌細胞G1期向S期轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮重要作用，并通過E2F途徑與腫瘤的生長及骨轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[10]。已有報道提示在肝細胞癌中DEPDC1的表達與預后相關(guān)[13]。但在NBNC-HCC患者中，DEPDC1是否與在肝炎病毒相關(guān)性肝癌具有同樣的促進作用尚無證據(jù)。

本研究首先通過實時定量PCR證實在肝癌組織中，DEPDC1基因高表達率為73.2%；免疫組化染色發(fā)現(xiàn)肝癌組織DEPDC1染色均呈陽性著色，且肝癌組織中的表達顯著高于癌旁組織。表示在NBNC-HCC組織中，DEPDC1的高表達為常態(tài)。在DEPDC1高表達組，腫瘤分化程度較低表達組低，TNM分級晚，甲胎蛋白值較高，同時微血管癌栓發(fā)生率(69.7%)較低表達組(34.5%)明顯增高。目前認為，腫瘤的生物學行為是影響預后的決定性因素，包括腫瘤的分化程度、侵襲性、表面標記、血管形成、免疫逃逸等諸多方面。而TNM、甲胎蛋白、微血管癌栓是分化程度的具體體現(xiàn)。大量研究均表明，甲胎蛋白水平與HCC的分化程度及預后顯著相關(guān)[14]。同時微血管癌栓的出現(xiàn)導致腫瘤經(jīng)門脈播散，已被證實是肝癌轉(zhuǎn)移、復發(fā)的主要途徑。這些都提示DEPDC1基因在NBNC-HCC發(fā)展中的作用與腫瘤的生物學行為直接相關(guān)。這一結(jié)果基本與既往報道的肝炎病毒相關(guān)性肝癌中結(jié)果類似，提示DEPDC1基因的作用很可能位于多種致癌因素作用最終的共同通路上。

綜上所述，本研究從基因及組織學水平檢測了NBNC-HCC組織中DEPDC1的表達情況，發(fā)現(xiàn)DEPDC1基因在NBNC-HCC組織中高表達，并與腫瘤的分期及分化程度相關(guān)。結(jié)合既往的研究結(jié)果，提示DEPDC1基因在肝細胞癌發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且很可能是多種致癌因素最終的共同通路，有著重要的臨床意義。