洪冰杰 許 鑫 侯文勝 于麗杰 韓天富,?

(1哈爾濱師范大學生命科學與技術學院,黑龍江哈爾濱 150025;2 中國農業(yè)科學院作物科學研究所/農業(yè)部北京大豆生物學重點實驗室, 北京 100081)

大豆[Glycine max (L.) Merr.]是世界上最重要的油料作物和高蛋白糧食作物之一,也是轉基因品種比例最高、種植面積最大的作物[1]。 目前,大豆全基因組測序工作已經完成,據(jù)估計,大豆中可編碼蛋白的基因數(shù)量約5 萬個[2],對數(shù)量如此龐大的基因進行功能驗證是大豆生物技術和遺傳育種工作者的研究重點。目前,已建立了多種基因表達研究系統(tǒng),主要包括組成型、組織特異性型和化學誘導型三類[3-4],其中,花椰菜花葉病毒啟動子(CaMV35S)是應用最廣泛的組成型啟動子,研究表明,該啟動子可驅動外源基因在任何組織、器官內進行持續(xù)、高效的表達[5],但過量表達外源基因可能會對植株的生長發(fā)育造成不利影響,并影響對試驗結果的判斷。 當需要在特定組織、器官和特定發(fā)育階段表達目的基因時,組成型啟動子并不適合[6]。 為了能在時間和空間上實現(xiàn)對目的基因表達的人工調控,研究者常采用組織特異型啟動子,該類啟動子可在特定組織、器官內啟動目的基因表達,但由于基因表達限定在少數(shù)類型的細胞和組織內,且無法對表達時期加以控制,使其在基因功能研究中的應用受到限制[7-8]。 與上述兩類啟動子相比,化學誘導型啟動子可在誘導劑存在的條件下調節(jié)基因表達的開啟和關閉,且基因表達量與誘導強度存在一定的劑量關系,能真正實現(xiàn)對基因表達的精準調控[6]。 目前,已建立了多種化學誘導系統(tǒng)[8],包括殺蟲劑誘導表達系統(tǒng)[9]、類固醇誘導表達系統(tǒng)[10-11]、四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)[12]、銅離子誘導表達系統(tǒng)[13]和乙醇誘導表達系統(tǒng)[14]等。 其中,乙醇誘導表達系統(tǒng)具有本底表達低、誘導效率高(少量的乙醇即可對基因表達產生顯著影響)及誘導劑安全無毒等優(yōu)勢,具有較大的研究價值和生產應用潛力[15]。 該系統(tǒng)已在擬南芥[14]、甘蔗[16]、水稻[17]、煙草[18]、番茄[19]、油菜[20]和長春花[21]等植物中得到成功應用,但在大豆中尚鮮見報道。

大豆是典型的短日照作物,光周期反應敏感[22]。在大豆開花控制途徑中,GmFT2a 是整合開花信號的關鍵基因,該基因的過量表達可使開花期明顯提前[23-24]。 本研究采用發(fā)狀根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)介導的根系轉化體系,在大豆根系中建立目的基因表達可控的化學誘導表達系統(tǒng),并以報告基因GUS 和目的基因GmFT2a 為例,研究乙醇誘導表達系統(tǒng)在大豆發(fā)狀根中的誘導效率,以期為大豆基因功能研究和大豆開花期、成熟期的人工調控提供新的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料

pALCA 啟動子和轉錄因子ALCR 的克隆載體由美國Syngenta Biotechnology 公司Martha M. Dunn 博士饋贈。 表達載體骨架pGFPGUSg 由pGFPGUSplus[25]改造而來,其中的潮霉素基因被置換成GFP 基因。 試驗過程中使用的載體及菌種均由中國農業(yè)科學院作物科學研究所大豆分子育種實驗室保存。

大豆品種為自貢冬豆,該品種原產于四川省自貢市,為光周期反應敏感的晚熟品種,具有開花逆轉現(xiàn)象,是大豆光周期反應研究的模式材料[26]。

1.2 載體構建

1.2.1 誘導啟動子克隆 參照Caddick 等[27]的方法構建載體,引物詳見表1。 從ALCA 克隆載體SYN15中克隆TATA box 及其上游的246 bp 片段,與mini35S進行同源重組,融合為完整的啟動子片段,命名為ALCA-mini35S。 mini35S 序列為TCTATATAAGGAAGT TCATTTCATTTGGAGAGAACACGGGGGACT。 參照北京全式金生物技術有限公司(TransGen Biotech)提供的pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit 試劑盒說明書進行片段同源重組。

表1 引物序列表Table 1 Sequences of primers used in this study

1.2.2 表達載體構建 乙醇誘導表達載體的部分結構見圖1。 載體T-DNA 區(qū)包含3 個轉錄單元,分別為35S 啟動子驅動ALCR 表達的轉錄單元,ALCA-mini35S誘導啟動子驅動目的基因表達的轉錄單元和35S 啟動子驅動標記基因GFP 表達的轉錄單元。

圖1 乙醇誘導表達系統(tǒng)載體T-DNA 區(qū)結構示意圖Fig.1 The T-DNA schematic diagram of ethanol inducible expression system

構建GUS 表達載體時先用Hind Ⅲ和Xba Ⅰ酶切ALCA-mini35S 片 段 和 pGFPGUSg 載 體, 將 ALCAmini35S 片段連接至pGFPGUSg 上,形成過渡載體1;利用XbaⅠ和SacⅠ將GUS 與過渡載體1 骨架連接得到過渡載體2;從SYNp17516 載體克隆ALCR 片段,用Pml Ⅰ和Bgl Ⅱ酶切過渡載體2,利用片段同源重組將ALCR 片段與過渡載體2 骨架連接,形成完整的GUS表達載體。

GmFT2a 表 達 載 體(ALCA-mini35S-GmFT2a) 與GUS 表達載體的構建流程基本相似,區(qū)別僅在于目的基因為GmFT2a。

1.3 轉基因發(fā)狀根的獲得和鑒定

用電擊法將轉化載體轉入發(fā)狀根農桿菌K599中,經PCR 鑒定后保留陽性菌落。 以自貢冬豆為試驗材料,通過K599 菌株介導的根系轉化體系轉化得到轉基因發(fā)狀根[28]。 當轉基因發(fā)狀根生長至13 ～15 d時,借助綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的顯色特征,利用裝有熒光激發(fā)模塊的SMZ1500 體視顯微鏡(Nikon,日本)鑒定轉基因陽性發(fā)狀根。

1.4 cDNA 的獲得和基因表達測定

將發(fā)狀根用液氮研磨成粉末后,按照TransZol Up試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)說明書提取總RNA。 然后按照EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒說明書(北京全式金生物技術有限公司)獲得cDNA,稀釋10 倍后保存。實時熒光定量PCR(RT-qPCR)按照KAPASYBR FAST qPCR Kit Master Mix 說明書操作,以GmActin 為內參基因[29],每個樣本設3 次重復。 RT-qPCR 引物序列見表1。

1.5 GUS 酶活測定

采用熒光分析法測定GUS 酶活性。 將植物樣品用液氮研磨成粉末,加入1 mL GUS 提取液,混勻1 min,15 000 r·min-1、4℃條件下離心10 min,吸取10 μL 上清液于新的離心管中,加入90 μL GUS 反應液,37℃反應1 h,加入900 μL 終止液終止反應。 溶液配制參照Chen 等[30]的方法,其中1 mg·mL-1牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)標準溶液為Bradford 蛋白質定量試劑盒自帶。 每個樣品設置1 個反應時間為0 min 的空白對照,測定其在激發(fā)光365 nm、發(fā)射光455 nm 下的熒光光度值[31],平行測量3 次。

采用GUS 組織化學染色法[32]對發(fā)狀根進行染色。 將組織浸入GUS 染液中放置過夜,染色完成后,將組織依次用50%、70%和90%乙醇脫色,最后用70%乙醇浸泡過夜。

1.6 不同濃度乙醇處理下發(fā)狀根中GUS 相對表達量及GUS 酶活性的測定

將ALCA-mini35S-GUS 發(fā)狀根及非轉基因發(fā)狀根分別浸入含設定濃度乙醇的1/2 MS 液體培養(yǎng)基中。經不同濃度乙醇誘導24 h 后取樣,測定GUS 相對表達量和GUS 酶活性。 每1 條主根及其上著生的側根為1個轉化事件,統(tǒng)計為1 個樣本。

1.7 不同誘導時段發(fā)狀根中GUS 相對表達量及GUS 酶活性的測定

將ALCA-mini35S-GUS 發(fā)狀根與非轉基因發(fā)狀根分別浸入含0.05%乙醇和不含乙醇的1/2 MS 液體培養(yǎng)基中。 處理期間分期取樣,測定GUS 相對表達量和GUS酶活性。 測定時將同一處理的發(fā)狀根隨機分為3 組,每一組混合連續(xù)取樣為一個生物學重復,共3 次重復。

1.8 乙醇誘導處理下轉基因發(fā)狀根中GmFT2a 的表達量測定

將ALCA-mini35S-GmFT2a 發(fā)狀根分為2 組,一組用含0. 05%乙醇的1/2 MS 液體培養(yǎng)基處理,另一組用不含乙醇的1/2 MS 液體培養(yǎng)基處理,72 h后同時取樣。 以非轉基因發(fā)狀根為對照。 每1 條主根及其上著生的側根為1 個轉化事件,統(tǒng)計為1個樣本。

2 結果與分析

2.1 轉基因發(fā)狀根的鑒定

由圖2 可知,轉基因發(fā)狀根中帶有35S 啟動子驅動報告基因GFP 表達的轉錄單元,在激發(fā)光照射下,GFP 蛋白可發(fā)出綠色熒光,說明載體導入大豆發(fā)狀根,并將T-DNA 區(qū)插入轉基因發(fā)狀根中。

圖2 轉基因發(fā)狀根的鑒定Fig.2 Identification of transgenic hairy root

2.2 不同濃度乙醇處理下GUS 的表達分析

2.2.1 非轉基因發(fā)狀根中GUS 的表達分析 由表2可知,不同濃度乙醇處理下非轉基因發(fā)狀根中GUS 表達量極低,差異不顯著,說明乙醇未能促進非轉基因大豆發(fā)狀根中GUS 的表達。 由表3 可知,不同濃度乙醇處理下GUS 酶活差異也不顯著。 由圖3 可知,非轉基因根在不添加乙醇處理(CK) 和添加乙醇處理(0.05%)下均未染色,說明乙醇不能誘導發(fā)狀根中GUS 的本底表達。

2.2.2 不同濃度乙醇處理下轉ALCA-mini35S-GUS 發(fā)狀根中GUS 的表達分析 由表4 可知,不同濃度乙醇處理下轉基因發(fā)狀根中GUS 的表達量均上調,為CK的3.29 ～8.04 倍。 乙醇濃度為0.01%和0.05%時,GUS 的表達量與CK 差異極顯著(P＜0.01),且乙醇濃度為0.05%時GUS 表達量最高,變異范圍為0.03 ～39.06。 由表5 可知,與CK 相比,不同濃度乙醇處理下GUS 酶活均增加,為CK 的1.81 ～3.58 倍。 乙醇濃度為0.01%和0.05%時,GUS 酶活與CK 差異極顯著(P＜0.01),且在乙醇濃度為0.05%時最高,變異范圍為7.57～201.24。 樣本間GUS 表達量和GUS 酶活差異明顯,其原因可能是不同樣本(發(fā)狀根)為獨立的轉化事件,GUS 表達量受插入位置、拷貝數(shù)等因素的影響較大。

表2 不同濃度乙醇誘導下非轉基因發(fā)狀根中GUS 相對表達量Table 2 Relative expression level of GUS in non-transgenic hairy root treated with different ethanol concentrations

表3 不同濃度乙醇處理下非轉基因發(fā)狀根中GUS 酶活Table 3 GUS enzyme activity in non-transgenic hairy root treated with different ethanol concentrations

表4 不同濃度乙醇誘導下轉基因發(fā)狀根中GUS 相對表達量Table 4 Relative expression level of GUS in transgenic hairy root treated with different ethanol concentrations

表5 不同濃度乙醇處理下轉基因發(fā)狀根中GUS 酶活Table 5 GUS activity in transgenic hairy root treated with different ethanol concentrations

圖3 轉基因和非轉基因發(fā)狀根GUS 染色結果Fig.3 GUS staining of transgenic and non-transgenic soybean hairy roots

2.3 不同誘導時段轉ALCA-mini35S-GUS 發(fā)狀根中GUS 表達及GUS 酶活分析

由圖4 可知,ALCA-mini35S-GUS 發(fā)狀根中GUS 的表達量隨著處理時間的增加呈先上升后下降的趨勢。0.05%乙醇處理1 h 后,GUS 的表達量明顯升高;當處理60 h 時,GUS 表達量達到最高值。 由圖5 可知,GUS酶活隨著處理時間的增加也呈先上升后下降的趨勢,誘導2 h 時GUS 酶活略微升高,72 h 時GUS 酶活達到最大值。 上述結果表明,GUS 酶活達到最高值的時間晚于GUS 表達量,表明GUS 表達一段時間后GUS 蛋白的合成量才達到最高值。

2.4 乙醇誘導后ALCA-mini35S-GmFT2a 發(fā)狀根中GmFT2a 表達分析

由表6 可知,TE 的GmFT2a 的相對表達量由TN的0.49 上調到75.67,增加了約150 倍,極大值為196.22,大約相當于初始值的400 倍。 NN 的GmFT2a的表達量由0 增加到NE 的0.33,差異不顯著。 RTPCR 結果顯示,0.05% 乙醇處理后ALCA-mini35SGmFT2a 發(fā)狀根(TE)中能夠檢測到GmFT2a mRNA,而在0%乙醇處理72 h 的ALCA-mini35S-GmFT2a 發(fā)狀根(TN)、0.05%乙醇處理72 h 的非轉基因發(fā)狀根(NE)和0%乙醇處理72 h 的非轉基因發(fā)狀根(NN)中均未檢測到GmFT2a mRNA(圖6),表明0.05%乙醇處理ALCA-mini35S-GmFT2a 發(fā)狀根, 能夠顯著提高GmFT2a 的表達量。

表6 乙醇誘導后轉基因發(fā)狀根中GmFT2a 相對表達量Table 6 Relative expression level of GmFT2a in transgenic hairy roots treated with ethanol

圖4 不同誘導時段轉基因發(fā)狀根中GUS 相對表達量Fig.4 Relative expression level of GUS in transgenic hairy root treated under different inducing time

圖6 乙醇誘導后轉基因和非轉基因發(fā)狀根中GmFT2a 表達量Fig.6 GmFT2a expression in transgenic and non-transgenic hairy roots treated with ethanol

3 討論

化學誘導表達系統(tǒng)可對外源基因進行定時、定位、定量表達,實現(xiàn)對基因表達的精準調控[4-6]。 本研究采用發(fā)狀根農桿菌介導的根系轉化體系,在大豆中建立了乙醇誘導表達系統(tǒng),實現(xiàn)了對報告基因GUS 和目的基因GmFT2a 表達的人工調控,結果表明,乙醇誘導目的基因表達的水平與誘導劑乙醇在培養(yǎng)基中的濃度相關,當乙醇濃度為0.05%時,GUS 表達量和GUS 酶活最高。 與前人研究相比,本試驗的大豆最佳乙醇誘導濃度低于擬南芥(2%)[14]、番茄(0.1%)[19]及胡楊(2%)[33],這可能與本研究采用培養(yǎng)皿誘導有關。 在組織培養(yǎng)條件下,將乙醇添加到液體培養(yǎng)基中與發(fā)狀根充分接觸,同時培養(yǎng)皿的封閉環(huán)境也最大程度地減少了乙醇蒸發(fā),保證了其濃度的穩(wěn)定。 0.05%乙醇處理1 h 后GUS 的表達量開始升高,GUS 酶活在2 h 后明顯上升,表明乙醇誘導表達系統(tǒng)在大豆發(fā)狀根中具有快速響應的特點,這與在擬南芥中的研究結果相近[14]。

本試驗結果表明,乙醇誘導表達系統(tǒng)對目的基因的誘導效率較高。 該系統(tǒng)可應用于基因功能的快速鑒定,并在以根系為受體的生物反應器構建中具有潛在利用價值。 此外,目前大豆根系轉化材料尚不能通過植株再生途徑進行繁殖,如何在可遺傳的整株材料中實現(xiàn)大豆基因的化學誘導表達仍是今后研究的重點。

在本研究中,同一處理下轉基因樣本之間報告基因GUS 和目的基因GmFT2a 的表達量差異較大,原因可能是每個樣本(發(fā)狀根)均由1 個受到轉化的單細胞發(fā)育而來,是獨立的轉化事件,外源基因的插入位點和拷貝數(shù)等內在因素均可導致基因表達量出現(xiàn)差異[34]。

4 結論

本研究構建了驅動報告基因GUS 和目的基因GmFT2a 表達的乙醇誘導表達載體并轉入大豆發(fā)狀根,成功實現(xiàn)了外源基因在大豆中的乙醇誘導表達。該系統(tǒng)具有快速誘導和高效率表達的特性。 本研究結果為大豆基因功能研究和轉基因育種提供了新的技術手段。