魏玲霞 王 穎 郭 蓉 杜 丹 毛英杰 楊 超 黃英金 王兆海,?

(1 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點實驗室,江西 南昌 330045;2江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,江西 南昌 330045)

水稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的糧食作物之一,也是單子葉模式植物。 葉片是植物光合作用的重要器官,水稻產(chǎn)量和品質(zhì)與葉片的光合作用密切相關(guān)[1]。 葉色變異是指植物色素的代謝或穩(wěn)定性發(fā)生異常從而造成葉片顏色改變。 大量研究表明,葉色變異突變體是研究植物光合作用[2]、解析植物色素代謝途徑[3]、葉綠體發(fā)育途徑[4]、光形態(tài)建成[5]、核質(zhì)互作信號途徑[6-7]等生物學(xué)過程的重要材料。 此外,水稻葉色突變體也廣泛用于作物性狀標(biāo)記、不育系良種繁殖等領(lǐng)域的研究[8-11]。

目前,水稻中共有11 個葉綠素合成關(guān)鍵酶基因被克隆,除CAO2[12]基因的T-DNA 插入突變體無可見突變表型外,其余10 個基因,包括RLIN1[13]、ChlH[14]、ChlI[15]、 ChlD[15-16]、 ChlM[17]、 CRD1[18-19]、 PORB[20]、DVR[21]、YGL1[22]和CAO1[12,23]突變會導(dǎo)致水稻葉片出現(xiàn)黑斑、黃色、黃綠、白化、光漂白等葉色變異表型。 此外,葉綠素降解途徑中的基因發(fā)生突變,也會導(dǎo)致葉色變異,如水稻NYC1 和NOL 基因編碼蛋白相互作用共同形成葉綠素b 還原酶,發(fā)揮降解葉綠素b 的作用,突變體nyc1 和nol 因葉綠素b 降解受阻而導(dǎo)致其后期葉片持綠[24-25]。 血紅素代謝途徑基因的突變,通常會影響葉綠素的合成,從而導(dǎo)致葉色變異,如水稻突變體ygl2 因血紅素加氧酶基因的突變,導(dǎo)致葉片呈黃綠葉表型[26]。 類胡蘿卜素合成途徑中的基因突變也會導(dǎo)致葉色突變體的產(chǎn)生,如水稻八氫番茄紅素脫氫酶PDS、ζ-胡蘿卜素脫氫酶ZDS、β-環(huán)化酶β-LCY 和類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO 等基因的突變均會導(dǎo)致類胡蘿卜素的合成途徑受損,進(jìn)而引起光氧化,出現(xiàn)黃化、白化或光漂白等葉表型突變體[27-29]。

截至目前,水稻中已發(fā)現(xiàn)了多種與葉綠體發(fā)育相關(guān)的基因,其突變會導(dǎo)致葉綠體發(fā)育異常,進(jìn)而影響色素的合成和穩(wěn)定,從而導(dǎo)致葉色變異。 YGL138(t)基因被預(yù)測編碼1 個“信號識別顆粒54 kD 蛋白”,在葉綠體中多肽的形成和定位運輸方面起作用,并參與葉綠體的發(fā)育過程,其突變體ygl138 表現(xiàn)出黃綠葉[30]。質(zhì)體酪蛋白酶基因VYL 在幼葉葉綠體的發(fā)育過程中發(fā)揮作用,其突變導(dǎo)致水稻葉片呈淡綠萎黃葉[31]。WSL3 基因編碼質(zhì)體RNA 聚合酶的重要組分,TCD10基因編碼1 個質(zhì)體定位的PPR 蛋白,它們的突變導(dǎo)致植株葉片在低溫下出現(xiàn)白化表型,這2 個基因參與低溫脅迫下葉綠體的早期發(fā)育[32-33]。 定位和克隆更多的葉色突變基因,有助于更加全面地闡明葉色突變機制。

本研究對前期獲得的1 個性狀穩(wěn)定遺傳的水稻黃綠葉突變體ygl15 進(jìn)行表型分析和基因定位,以期為突變體ygl15 進(jìn)一步克隆及其基因功能研究奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻黃綠葉突變體ygl15 來源于喜玉/ /PA64S/豐富占的雜交群體分離后代(由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李陽生教授提供)。 經(jīng)在海南陵水、湖北武漢、江西南昌等地多代繁殖和觀察,突變體ygl15 的黃綠葉性狀能穩(wěn)定遺傳。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉綠素含量測定 取野生型和突變體ygl15植株苗期葉片,液氮研磨,采用丙酮法[34]測定葉綠素和類胡蘿卜素的含量。 每個樣品分別設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)和3 次技術(shù)重復(fù)。

1.2.2 基因表達(dá)分析 苗期葉片取樣后立即用液氮冷凍,-80℃保存?zhèn)溆谩?利用TRIZOL試劑盒(Invitrogen,美國)提取總RNA;將DNase 處理過的總RNA 用MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶(Promega,美國)合成總cDNA。 熒光定量PCR 采用2×TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑(TaKaRa,日本)在Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR 儀(BioRad,美國)上進(jìn)行。 內(nèi)參基因為Actin1、Profilin-2和UBC[35]。 每個樣品分別設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)和3 次技術(shù)重復(fù)。

1.2.3 定位群體的構(gòu)建和遺傳分析 以突變體ygl15為母本,分別與粳稻品種中花11 和日本晴雜交,得到雜交F1種子;F1植株再自交得到F2種子。 分單株收取F2種子進(jìn)行種植。 觀察雜交F1和F2植株葉片的顏色表型并進(jìn)行遺傳分析;以突變體ygl15/中花11 的F2群體作為初步定位和精細(xì)定位群體。

1.2.4 基因定位 參照文獻(xiàn)[36]進(jìn)行。 在突變體ygl15/中花11 的F2群體植株中隨機選取66 株黃綠葉突變表型單株,提取葉片DNA。 利用分布于12 條染色體上的突變體ygl15 與中花11 的多態(tài)性分子標(biāo)記,對這66 個單株進(jìn)行PCR 帶型分析,并進(jìn)行初步定位;根據(jù)NCBI(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上提供的水稻秈稻9311 和粳稻日本晴基因組序列,開發(fā)和篩選初步定位區(qū)間內(nèi)ygl15 和中花11 之間的多態(tài)性分子標(biāo)記并用于精細(xì)定位;在突變體ygl15/中花11 的F2群體植株中,對300 株黃綠葉突變表型單株取材,提取DNA。 利用PCR 檢測初步定位區(qū)間內(nèi)的多態(tài)性分子標(biāo)記這300 個F2黃綠葉突變表型單株中的交換單株,并進(jìn)行精細(xì)定位分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體ygl15 的黃綠葉葉色表型鑒定

在自然條件下,突變體ygl15 萌芽后從苗期開始表現(xiàn)出黃綠葉表型(圖1-A)。 與WT 相比,突變體ygl15 的葉綠素和類胡蘿卜素的含量顯著下降(圖2-B、C),表明突變體ygl15 的葉綠素合成受到抑制。

2.2 突變體ygl15 的農(nóng)藝性狀鑒定

由表1 可知,突變體ygl15 的株高、有效穗數(shù)、單株總粒數(shù)和單株實粒數(shù)分別較WT 顯著下降了17.2%、37.5%、51.6%和51.6%,其中,突變體ygl15 的株高和有效穗數(shù)極顯著高于WT;突變體ygl15 穗長、每穗粒數(shù)和結(jié)實率低于WT,但差異不顯著;突變體ygl15 千粒重較WT 提高了4.0%,且差異具有顯著性。

2.3 葉綠體基因的定量表達(dá)分析

利用熒光定量PCR 對葉綠素合成途徑、光合系統(tǒng)相關(guān)以及血紅素合成途徑的關(guān)鍵基因進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析。 結(jié)果表明,與WT 相比,突變體ygl15 中葉綠素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因HEMA1、ChlM、YGL1 和CAO1 的基因表達(dá)量均顯著上調(diào),其中HEMA1、ChlM和CAO1 極顯著上調(diào)(圖2-A);光合系統(tǒng)相關(guān)的關(guān)鍵基因PsaA、PsaB、PsbA 和PsbB 為葉綠體基因,它們的基因表達(dá)量也均顯著上調(diào),其中PsaA 和PsbA 極顯著上調(diào)(圖2-B);而血紅素合成途徑中的關(guān)鍵基因FCI和HO1 的基因表達(dá)量分別顯著、極顯著下調(diào),而FCII和HY 的基因表達(dá)量無明顯差異(圖2-C)。

2.4 ygl15 突變體的遺傳分析

利用突變體ygl15 與中花11 和日本晴分別進(jìn)行雜交,得到中花11/ygl15 和日本晴/ygl15 這2 個雜交組合,2 個組合F1表型均為正常綠葉表型,F1植株自交得到F2群體。 在2 個F2群體中肉眼觀察植株分別為綠葉和黃綠葉表型,=3.84,表明正常綠葉與黃綠葉植株數(shù)目均符合3 ∶1的分離比(表2),進(jìn)一步表明突變體ygl15 突變性狀受細(xì)胞核隱性單基因控制。

表1 野生型和突變體ygl15 的農(nóng)藝性狀鑒定Table 1 Identification of agronomic characteristics of the wild type and mutant ygl15

圖1 野生型(WT)和突變體ygl15 的葉色表型及色素含量Fig.1 Leaf color phenotype and pigment content of the wild type and mutant ygl15

2.5 突變體ygl15 的基因定位

ygl15 基因的初步定位和精細(xì)定位利用突變體ygl15 和中花11 的F2群體進(jìn)行。 篩取突變體ygl15 和中花11 之間的多態(tài)性SSR 分子標(biāo)記共121 對,均勻分布在12 條染色體上。 初步定位取材F2群體中66 株黃綠葉突變表型植株,將ygl15 基因初步定位在第3號染色體的多態(tài)性分子標(biāo)記RM14859 ～RM5551 之間,并與多態(tài)性分子標(biāo)記chr03mm2581 緊密連鎖。 初步定位的物理區(qū)間距離約1.28 Mb(圖3-A)。

為了進(jìn)一步縮小ygl15 基因的定位區(qū)間,選取F2群體中的300 株黃綠葉突變表型植株進(jìn)行精細(xì)定位。根據(jù)已公布的粳稻品種日本晴和秈稻品種9311 的序列差異,在初步定位區(qū)間內(nèi)開發(fā)出6 對多態(tài)性分子標(biāo)記 M07982、 M08063、 M08124、 M08139、 M08175 和M08216(表3)。 最終將ygl15 基因限定在多態(tài)性分子標(biāo)記M08124 ～M08175 之間,并與多態(tài)性分子標(biāo)記M08139 緊密連鎖。 精細(xì)定位的物理區(qū)間距離約79 kb(圖3-B)。

3 討論

本研究中突變體ygl15 從種子萌發(fā)后,葉片持續(xù)表現(xiàn)出黃綠葉表型;ygl15 葉片中葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著下降,與前人關(guān)于水稻黃綠葉突變體的研究結(jié)果類似[20,26,30]。 水稻的黃綠葉突變對農(nóng)藝性狀的影響存在差異,如水稻黃綠葉突變體yl-1 的葉綠素含量下降,導(dǎo)致其株高、每穗粒數(shù)、單株產(chǎn)量嚴(yán)重下降,但其千粒重和結(jié)實率增加[17];水稻黃綠葉突變體824ys的葉綠素含量下降且植株生長發(fā)育嚴(yán)重遲緩,最終導(dǎo)致其株高、有效分蘗數(shù)、有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重均顯著下降[20]。 水稻淡黃葉突變體ygr[37]和黃綠葉突變體ygl14(t)[38]的葉綠素和類胡蘿卜素的含量均顯著下降,但其株高、穗長、每穗粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重等性狀未受到影響。 本研究中突變體ygl15除葉色變異外,其株高、有效穗數(shù)、單株總粒數(shù)和實粒數(shù)也均下降,而每穗粒數(shù)和結(jié)實率與野生型差異不顯著,千粒重略有上升。 有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重是水稻產(chǎn)量的關(guān)鍵決定因素,對突變體ygl15的進(jìn)一步研究也將有助于解析葉色基因調(diào)控水稻產(chǎn)量的機理。

圖3 ygl15 基因的定位Fig.3 Mapping of the ygl15 gene

表2 2 個雜交組合F2 群體的性狀分離Table 2 Segregation of F2 populations from two crosses

表3 ygl15 基因定位所用的分子標(biāo)記引物序列Table 3 Primer sequence of molecular markers for ygl15 gene mapping

葉綠體中的蛋白大部分由細(xì)胞核基因組編碼,少部分由質(zhì)體基因組編碼,葉綠體的狀態(tài)受到細(xì)胞核的監(jiān)控,可能存在質(zhì)核反饋信號調(diào)控質(zhì)體定位的核編碼基因的表達(dá)[39]。 突變體ygl15 中所檢測的核編碼的葉綠素合成相關(guān)基因和質(zhì)體編碼的光合系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)均受到激發(fā)上調(diào),這與葉綠素合成途徑中的擬南芥鎂原卟啉Ⅸ甲基轉(zhuǎn)移酶基因突變體chlm[40]、鎂原卟啉Ⅸ單甲酯環(huán)化酶基因突變體crd1[41]以及水稻鎂螯合酶亞基ChlD 蛋白編碼基因突變體ygl7[15]的研究結(jié)果一致。 但在水稻葉綠素合酶基因突變體ygl1 中,葉綠素合成和光合系統(tǒng)相關(guān)基因卻呈下調(diào)表達(dá)[21]。YGL15 基因參與調(diào)控這些質(zhì)體定位基因的表達(dá)模式機理,還有待ygl15 基因克隆后的進(jìn)一步研究。

通過初步定位和精細(xì)定位,最終將目標(biāo)基因ygl15定位在水稻第3 號染色體上約79 kb 的物理區(qū)間內(nèi)。目前已報道的水稻黃綠葉基因有3 個被定位到第3 號染色體上,即葉綠體“信號識別顆粒43 kD 蛋白”編碼基因OscpSRP43[42]、聯(lián)乙烯還原酶基因OsDVR[20]以及鐵氧化還原蛋白基因OsFdC2[43]。 OscpSRP43 被定位在第3 號染色體短臂上的分子標(biāo)記RM569 ～I(xiàn)D32 之間,該基因的突變體w67 葉片中的葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著低于野生型;突變體植株的發(fā)育稍遲緩于野生型,其株高、分蘗數(shù)、穗長、每穗粒數(shù)顯著低于野生型,而千粒重?zé)o變化[42]。 OsDVR 基因被定位在第3 號染色體短臂上的分子標(biāo)記PR809 ～PR826 之間,該基因突變體824ys 葉片中的葉綠素含量較野生型顯著降低;突變體植株的發(fā)育嚴(yán)重遲緩于野生型,其株高、有效分蘗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重均明顯下降[20]。OsFdC2 基因被定位在第3 號染色體長臂上的分子標(biāo)記C4～C5 之間,該基因的突變體501ys 葉片中的葉綠素和類胡蘿卜素含量略低于野生型;突變體植株的發(fā)育受影響小,其株高、有效分蘗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重僅稍低于野生型,下降幅度并不顯著[43]。 綜上,這些基因均沒有位于ygl15 的精細(xì)定位區(qū)間內(nèi),與ygl15 均不是等位基因,且突變體的表型也與ygl15 的表型有區(qū)別。 因此,水稻ygl15 基因極有可能是一個新的黃綠葉控制基因。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,與野生型水稻相比,黃綠葉表型突變體ygl15 葉片中的葉綠素和類胡蘿卜素含量均下降,其株高、有效穗數(shù)、單株總粒數(shù)和單株實粒數(shù)等農(nóng)藝性狀指數(shù)下降,千粒重略有增加,葉片中葉綠素合成和光合系統(tǒng)相關(guān)酶基因表達(dá)上調(diào),但血紅素合成基因下調(diào)。 遺傳分析表明,突變體ygl15 受單個細(xì)胞核隱性基因控制。 水稻ygl15 基因被定位在第3 號染色體的多態(tài)性分子標(biāo)記M08124 ～M08175 之間,物理區(qū)間距離約79 kb,推測水稻ygl15 基因極有可能是一個新的黃綠葉控制基因。 本研究結(jié)果為進(jìn)一步克隆ygl15突變基因和研究基因功能奠定了一定的理論基礎(chǔ)。