張蕓飛,李 鵬,黃利華,李汝紅*,邢曉為*

(1.中南大學湘雅三醫(yī)院醫(yī)學實驗中心,中國湖南長沙430013;2.昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院普外科,中國云南昆明650051)

供體短缺是器官移植中面臨的一大難題,許多患者因無法及時得到供體而忍受痛苦甚至死亡。異種移植是解決器官移植短缺的有效手段之一。豬的繁育較快,其器官與人體器官在解剖結(jié)構(gòu)和生理上具有較高的相似性,而且豬的疾病在種間傳播有限且易控制,因而其作為器官移植供體來源已得到廣泛認可,如豬胰島細胞移植治療1型糖尿病[1]、豬心臟移植治療心臟病[2]等。異種移植應用于臨床的阻礙除了異種間的免疫排斥反應之外,生物安全問題也值得高度關注。目前,α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因敲除豬以及基因修飾豬的出現(xiàn)使異種移植克服了免疫排斥反應,取得了長足的進步[3～4]。另外,通過培育無特定病原體(specific pathogen-free,SPF)豬群可控制一些病原菌的傳播[5]。然而,豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)以“前病毒DNA”的形式整合在豬的細胞基因組中,隨細胞染色體的復制而復制,無法通過SPF培育消除[6]。

PERV是一種C型逆轉(zhuǎn)錄病毒,被認為是異種移植中微生物感染的主要風險之一[7]。研究發(fā)現(xiàn),含有PERV的異種器官有感染人類細胞的潛在風險,可能引起人畜共患病[8]。因此,PERV種間傳播的潛在風險成為了異種移植中人們關注的焦點問題。本文就PERV在異種移植中的感染風險及預防策略綜述如下。

1 PERV的基本特征

1.1 PERV的分子結(jié)構(gòu)

PERV由單股雙鏈RNA構(gòu)成,包括編碼序列和非編碼序列。非編碼序列位于RNA的兩端,包括5′端的R和U5區(qū)以及3′端的U3和R區(qū)。編碼區(qū)由gag、pol和env 3個功能基因組成(圖1)[9]。gag基因編碼基質(zhì)(matrix,MA)、衣殼(capsid,CA)和核衣殼(nucleocapsid,NC)的結(jié)構(gòu)蛋白;pol基因編碼蛋白酶(protease,PR)、逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase,RT)和整合酶(integrase,IN);env基因編碼囊膜糖蛋白,主要包括表面蛋白SU(gp70)和跨膜蛋白TM(p15E)[10]。引物結(jié)合位點(primer-binding site,PBS)位于U5和gag之間,剪接供體(splice donor,SD)位于PBS序列的下游,隨后是包裝信號Ψ(psi)[11]。剪接受體(splice acceptor,SA)位點位于env和U3之間,多嘌呤管道(polypurine tract,PPT)位于其后。不同豬種的PERV拷貝數(shù)不同,中國小型豬的PERV可達4～96個拷貝[12]。

1.2 PERV的分型

gag基因和pol基因高度保守,env基因存在一定差異,其編碼的囊膜糖蛋白結(jié)構(gòu)不同,決定了病毒的特異性?；诖?人們將PERV分為PERVA、-B和-C 3個亞群。PERV-A和PERV-B為多噬性,能夠感染幾種人源細胞;PERV-C為親噬性,僅感染豬源細胞。PERV-A和PERV-C可以形成PERV-A/C重組體,該重組體具有更高的復制效率[13]。

大量研究表明,PERV在不同的豬種之間的負載不平衡,不同豬種攜帶的PERV亞型有差異[14～18]。Fujimura等[14]對日本6個豬種進行檢測,發(fā)現(xiàn)這些豬種均攜帶PERV-A和PERV-B,而PERV-C的攜帶率存在差異。Semaan等[15]對G?ttingen小型豬攜帶的PERV進行研究,發(fā)現(xiàn)該豬種均存在PERV-A、-B和-C 3種亞型,但是未檢測到PERV-A/C重組體。

本課題組對中國地方豬種進行了大量的調(diào)查研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn):所有豬種均攜帶PERV,但PERV在不同的豬種之間負載不平衡。有的豬種攜帶PERV-A、-B和-C 3種亞型,如:大圍子豬、寧鄉(xiāng)豬,其中寧鄉(xiāng)豬中可檢測到PERV-A/C重組體[16～17];而有的豬種主要攜帶PERV-A和PERV-B,如:沙子嶺豬,我們檢測了31頭個體,其中29頭個體PERV-C缺失[18]。在對中國地方豬種進行了大量的調(diào)查研究后,我們篩選到了合適的豬種進行培育,為臨床選擇合適的供體奠定了基礎[19]。

2 PERV的檢測方法

PERV的檢測包括DNA和RNA的分析(PCR和RT-PCR)、PERV核酸水平的定量測定(實時PCR和實時RT-PCR)、逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定(RT)以及病毒和受體蛋白檢測(免疫學方法)[20]。

近年來,許多學者對傳統(tǒng)PERV檢測技術(shù)進行了改進,使其檢出率大大提高[21～23]。Shah 等[21]將實時定量PCR與PERV-gag保守區(qū)序列捕獲法結(jié)合以檢測PERV,靈敏度可達每微克人DNA中檢測 0.005～0.028拷貝,特異性可達 98.2%～100%。Moon等[22]利用基于雙引物寡核苷酸(dual priming oligonucleotide,DPO)系統(tǒng)的多重PCR檢測PERV亞型,可以同時增加幾個靶標的檢測特異性和靈敏性。Yang等[23]開發(fā)了一種基于磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles,MNPs)與化學發(fā)光(chemiluminescence,CL)的檢測和分型方法,該方法快速、特異且具有很高的靈敏度,檢出限為100 amol。該研究團隊用該方法檢測了巴馬小型豬PERV亞型的相對拷貝數(shù),發(fā)現(xiàn)該豬種PERV-C的拷貝數(shù)極低[24]。以上方法在篩選供體豬和檢測人體是否有PERV感染中具有很好的應用價值,但其是否能夠應用于臨床還需更多的試驗驗證。

3 PERV的臨床感染風險

由于PERV能夠體外感染人類細胞,所以PERV的臨床感染風險越來越成為異種移植中人們關注的重點問題。1997年,Patience等[8]報道PERV能夠感染體外培養(yǎng)的人類細胞。隨后,Laan等[25]在移植豬胰島細胞的免疫缺陷小鼠中發(fā)現(xiàn)了PERV感染的證據(jù)。Martin等[26]將豬腎細胞PK15與不同原代人類細胞共培養(yǎng),在人內(nèi)皮細胞、血管成纖維細胞和腎小球系膜細胞中發(fā)現(xiàn)了PERV的存在,并且在PK15上清液培養(yǎng)的腎小球系膜細胞中也檢測到了PERV。此外,相關研究已經(jīng)證實,PERV能在體外感染外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和胚腎細胞(HEK293)系[9,27～29]。劉金鳳等[29]研究發(fā)現(xiàn),PERV 體外感染的HEK293雖沒有發(fā)生細胞病變,但其生長速度和細胞活力降低,推測PERV整合可能抑制了細胞的增殖。

盡管已有許多體外試驗證實PERV能夠感染人類細胞,但是目前尚沒有人類異種移植感染PERV的報道[30]。Valdesgonzalez等[31]在23名豬胰島細胞移植患者的白細胞中未檢測到PERV DNA的存在,并且長期隨訪期間也沒有發(fā)現(xiàn)PERV激活的證據(jù)。Morozov等[32]對8例接受豬胰島細胞移植的患者進行了分析,也得到了同樣的結(jié)論。Pitkin等[33]評估了接受體外生物人工肝治療的28例患者的PERV感染情況,發(fā)現(xiàn)所有患者在治療后5年內(nèi)其外周血單個核細胞的PCR檢測結(jié)果均為PERV陰性。我們課題組也對接受胰島移植的病人進行過檢測,未發(fā)現(xiàn)PERV在患者體內(nèi)復制和感染[1]。

值得我們注意的是,上述患者沒有使用免疫抑制劑或僅使用弱免疫抑制劑[30]。實際上,人體免疫系統(tǒng)對PERV具有很強的免疫力,一些限制性因子組成人體內(nèi)先天免疫系統(tǒng),在逆轉(zhuǎn)錄病毒復制的不同環(huán)節(jié)中發(fā)揮作用,如:APOBEC能夠破壞病毒DNA的合成;TRIM5α能在病毒進入細胞后結(jié)合病毒衣殼蛋白,限制其脫殼;TRIM28可阻斷病毒轉(zhuǎn)錄;鋅指抗病毒蛋白(zinc-finger antiviral protein,ZAP)可誘導病毒RNA的降解;tetherin可以捕獲被感染細胞表面的病毒顆粒,阻止病毒擴散[34]。當然,如果移植患者感染了HIV或服用了嗎啡等阿片類藥物,其機體APOBEC的表達將會受到抑制[35],此時移植病人還是存在PERV跨種系感染的風險。因此,在異種移植方面,PERV臨床感染風險仍是世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)所關注的核心問題之一。

4 臨床對PERV的預防策略

4.1 供體篩選

Lee等[36]發(fā)現(xiàn),PERV-A/C重組體的感染性大約比PERV-A高500倍。Mourad等[37]發(fā)現(xiàn),從出生到成年,豬胰島細胞中PERV的拷貝數(shù)沒有顯著變化,但新生胰島細胞中PERV的表達水平顯著低于成年胰島細胞。PERV在不同豬種之間的分布和負載不平衡,因此應選擇低拷貝、低表達、PERV-C陰性的豬種作為供體,以減少病毒的傳播。通過豬種篩選,可以找到PERV-C缺失的豬種作為候選供體。當然,所篩選的豬種還是有PERV-A和PERV-B,在臨床應用中仍存在潛在的PERV感染風險。

4.2 供體細胞包被

Crossan等[38]將藻酸鹽包被的PK15與HEK293和豬睪丸細胞共培養(yǎng),未檢測到PERV復制。葉征等[39]將新生豬胰島細胞經(jīng)微囊化后移植到狗體內(nèi),結(jié)果顯示:微囊化的豬胰島細胞能夠在受體肝臟內(nèi)存活并發(fā)揮作用,并且未發(fā)現(xiàn)PERV感染。這提示包被供體細胞可以有效阻止PERV的傳播。但是,該技術(shù)必須確保包被材料的質(zhì)量,若包被材料受損,PERV仍能穿過該屏障而感染人類細胞。

4.3 RNA干擾

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是與靶基因同源的雙鏈RNA所誘導的一種特異性基因沉默現(xiàn)象,是一種抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動、調(diào)控基因表達的監(jiān)控機制。利用RNA干擾技術(shù)能夠特異性剔除或關閉某些基因的表達。

目前已有許多團隊利用RNA干擾技術(shù)成功抑制了 PERV 的表達[40～41]。Dieckhoff等[40]應用RNA干擾技術(shù)抑制豬成纖維細胞中PERV的表達,其抑制效率達到了94.8%。隨后,該研究小組應用體細胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)制備了7頭PERV低表達的轉(zhuǎn)基因豬,檢測發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)基因豬各器官PERV的表達被有效抑制。Li等[41]應用shRNA-pol3對中國實驗性小型豬成纖維細胞PERV進行抑制,取得了較好的抑制效果,抑制后的PERV表達水平僅為野生型的7.9%。而且,將抑制了PERV的豬成纖維細胞與人HEK293細胞進行共培養(yǎng),未檢測到PERV跨種系傳遞。因此,RNA干擾技術(shù)也是預防PERV傳播的一個有效方法,但是該方法不能從根本上消除PERV。

4.4 抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物

逆轉(zhuǎn)錄病毒通過逆轉(zhuǎn)錄酶將其RNA基因組逆轉(zhuǎn)錄為DNA,并通過整合酶將DNA穩(wěn)定整合到細胞的基因組中。因此,抑制病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶的活性可以抑制PERV的感染。

逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑主要包括核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nucleoside reverse transcriptase inhibitor,NRTI)和非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor,NNRTI)兩種。其中胸苷類似物疊氮胸苷(azidothymidine,AZT)抑制PERV逆轉(zhuǎn)錄酶的效果最好[42]。

常用的整合酶抑制劑有雷特格韋(Raltegravir)和度魯特韋(Dolutegravir),已被美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準用于治療HIV。研究發(fā)現(xiàn),雷特格韋和度魯特韋也能夠有效地抑制PERV[43～44]。雷特格韋能夠抑制PERV的復制和整合酶活性,其IC50在納摩爾范圍內(nèi)[43]。有研究報道,雷特格韋和度魯特韋的IC50分別為 8.634±0.336 nmol/L 和 3.06±0.844 nmol/L,而 AZT 的 IC50為 1.923±0.691 μmol/L[44]。因此,整合酶抑制劑是最有效的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物。但抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療PERV感染后是否會出現(xiàn)毒副作用、PERV是否具有耐藥性等問題尚不清楚,因此不推薦使用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物作為預防PERV的首選方法。

4.5 基因編輯

許多學者試圖利用基因敲除技術(shù)從根本上消除PERV。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是繼ZFN(zinc-finger nuclease)和TALEN(transcription activator-like effector nuclease)技術(shù)之后的第3代基因組編輯技術(shù),由細菌和古細菌中存在的Ⅱ型系統(tǒng)經(jīng)人工改造而成。因設計簡便、可進行多基因編輯、編輯效率高,該技術(shù)成為國內(nèi)外學者們的研究熱點。

目前,已有學者成功應用CRISPR/Cas9技術(shù)對PERV進行了基因編輯。Yang等[45]利用該技術(shù)敲除了豬腎上皮細胞系(PK15)PERV pol基因的所有拷貝,使其感染人類細胞的能力降低了1 000倍。隨后,Niu等[46]使用CRISPR/Cas9技術(shù)滅活了豬原代細胞系中的全部PERV拷貝,并通過體細胞核移植技術(shù)產(chǎn)生了世界上首批PERV敲除的豬,能夠存活100 d,使人類從根本上消除PERV成為可能。然而,CRISPR/Cas9技術(shù)在敲除PERV基因方面并不成熟和完善。一方面,相關報道指出,在應用CRISPR/Cas9技術(shù)修飾基因組中的PERV基因后,所產(chǎn)生的基因修飾豬有一半在出生后不到4個月的時間就死亡[47],而且PERV基因的敲除對豬器官生理功能的影響目前尚不清楚。另一方面,CRISPR/Cas9技術(shù)仍存在一些缺陷亟待解決,如脫靶效應。Fu等[48]發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9編輯的人細胞中出現(xiàn)了高頻脫靶突變。而Iyer等[49]最近發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9編輯后的小鼠胚胎細胞脫靶突變比較罕見,與天然發(fā)生的突變頻率相當。目前,尚無研究報道CRISPR/Cas9技術(shù)對PERV基因編輯后豬供體器官是否會出現(xiàn)脫靶效應。因此,該方法還在探索階段,需要進一步完善后方可應用于臨床。

5 展望

PERV是WHO在異種移植領域所關注的核心問題之一,其跨種系感染的風險依然值得我們重視。目前,國內(nèi)外許多學者一直在試圖消除或減少PERV的潛在風險,如:篩選PERV低拷貝、低表達以及PERV-C陰性的豬種作為供體;利用微囊化包被供體細胞;利用RNA干擾技術(shù)使PERV基因沉默;利用逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑來抑制PERV的表達;利用基因編輯使PERV失活等。上述這些方法各有其優(yōu)缺點,尤其是CRISPR/Cas9技術(shù),雖然能夠從根本上消除PERV的影響,但是由于脫靶效應等,還暫時不能應用于臨床。PERV跨種系感染風險仍是阻礙異種移植大量應用于臨床的障礙之一。

本課題組長期從事豬胰島移植工作,積極探索消除PERV潛在影響的方法,目前已經(jīng)篩選了一些PERV-C陰性的豬種進行培育,如果結(jié)合RNA干擾技術(shù)和CRISPR/Cas9技術(shù)對這些豬種進行改造,有望獲得適合中國人群的異種胰島移植供體豬,為臨床大規(guī)模開展異種胰島移植提供可靠的候選供體。

綜上所述,了解PERV的特性,探索其預防策略,將有助于推動豬作為異種移植供體在臨床中的應用。