段入心 孟雷 王寧新

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，泰安 271000；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271000）

自1908年美國的Melander［1]首次發(fā)現(xiàn)美國加利福尼亞州梨圓蚧（Quadrspidiotus pernicious）對石硫合劑有抗藥性以來，昆蟲產(chǎn)生抗藥性的事例逐年增加，抗藥性增長的速度也呈上升趨勢。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前已有600多種害蟲對一種或多種殺蟲劑產(chǎn)生了一定的抗性，其中以鱗翅目和雙翅目昆蟲種類最多［2-3]。1957年世界衛(wèi)生組織（WHO）將昆蟲的抗藥性定義為：昆蟲具有耐受殺死正常種群大部分個體的藥量的能力，并在其群體內(nèi)發(fā)展起來的現(xiàn)象［4]。昆蟲抗藥性表現(xiàn)為連續(xù)多年在同一地區(qū)固定使用同一種農(nóng)藥，經(jīng)過一段時間后，當(dāng)再次使用該農(nóng)藥時，防治效果下降。當(dāng)前，昆蟲的抗藥性治理有多種方式，其中生物防治手段以其能夠有效控制害蟲、減少環(huán)境污染、低成本等優(yōu)勢已逐漸受到廣泛關(guān)注［5]。生物防治可利用天敵昆蟲、昆蟲信息素等，最近很多研究發(fā)現(xiàn)昆蟲共生菌與抗藥性有一定關(guān)系，這為昆蟲抗藥性治理及農(nóng)藥降解提供了新方向。

存在于昆蟲體內(nèi)的共生菌是與昆蟲在進(jìn)化過程中長期共存、互惠互利的微生物，在昆蟲體內(nèi)扮演著重要角色。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對昆蟲體內(nèi)共生菌的研究越來越重視。目前報(bào)道的昆蟲內(nèi)共生菌具有協(xié)助宿主營養(yǎng)代謝、調(diào)節(jié)宿主生殖能力、調(diào)節(jié)寄主適應(yīng)性和增強(qiáng)宿主抗藥性等功能。根據(jù)昆蟲與共生菌長期的進(jìn)化關(guān)系，可將昆蟲體內(nèi)的共生菌分為兩大類：初生共生菌和次生共生菌［6]。昆蟲體內(nèi)的初生共生菌是必需的，它們?yōu)槔ハx宿主提供氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)［7]；而次生共生菌對昆蟲來說不是必需的，一些研究表明次生共生菌與宿主的生殖能力、抗藥性等有一定的關(guān)聯(lián)［8]。如Wolbachia和殺雄菌屬Arsenophonus等共生菌除了被認(rèn)為與昆蟲宿主的生殖調(diào)控有關(guān)［9-11]，也有研究表明Wolbachia可以增強(qiáng)宿主的抗藥性［12]。Pang等［13]用一種Arsenophonussp.代替褐飛虱腸內(nèi)的常駐菌Arsenophonus后顯著降低了宿主對殺蟲劑的抗性，從而證明了褐飛虱腸道常駐菌Arsenophonus可以提高褐飛虱對殺蟲劑的抗性。

化學(xué)殺蟲劑的廣泛和不合理使用導(dǎo)致昆蟲產(chǎn)生抗藥性的現(xiàn)象日益增多。本文針對昆蟲共生菌介導(dǎo)的抗藥性研究，從昆蟲抗藥性機(jī)制、與昆蟲抗藥性相關(guān)的共生菌類群和相關(guān)研究進(jìn)展方面進(jìn)行了論述，并對其研究前景進(jìn)行展望。

1 昆蟲抗藥性機(jī)制

大多數(shù)研究認(rèn)為昆蟲抗藥性機(jī)理主要有2種：一種是代謝抗性，改變了靶標(biāo)處殺蟲劑的有效劑量，即生理抗性、生化抗性和行為抗性，與代謝抗性關(guān)系最大的解毒酶包括：非專一性的酯酶如羧酸酯酶等、細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的多功能氧化酶系、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶［14]和醛氧化酶［15]。另一種是靶標(biāo)抗性，通過變異改變靶標(biāo)的結(jié)構(gòu)或者降低靶標(biāo)對殺蟲劑的敏感性，進(jìn)而提高了昆蟲對殺蟲劑的耐受能力［16-18]，主要的靶標(biāo)有乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）、神經(jīng)軸突鈉離子通道（Sodium channel，SC） 和 γ-氨 基 丁 酸（Gamma-amino butyric acid，GABA）受體氯離子通道復(fù)合體等［19]。

目前多項(xiàng)研究指出，昆蟲體內(nèi)的共生菌對昆蟲的抗藥性也有一定的影響［20-22]。關(guān)于昆蟲體內(nèi)共生菌對昆蟲產(chǎn)生抗藥性的原因主要有3種：一種是昆蟲體內(nèi)共生的微生物能夠降解農(nóng)藥從而使昆蟲獲得降解農(nóng)藥的能力和抗藥性，如在點(diǎn)蜂緣蝽（Riptortus pedestris）上證明內(nèi)共生菌伯克霍爾德菌（Burkholderia）可降解有機(jī)磷農(nóng)藥殺螟松的毒害，使宿主的抗藥性增強(qiáng)［23-24]，Ramya等［25]證明小菜蛾（Plutella xylostella）腸道內(nèi)的共生菌蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）有降解茹蟲威的作用；第二種是昆蟲腸道微生物通過改變菌落結(jié)構(gòu)來激活宿主免疫系統(tǒng)，使宿主的抗藥性增強(qiáng)，劉浩［26]采用PCR-DGGE分子生物學(xué)技術(shù)對抗高效氯氰菊酯品系和敏感品系的德國小蠊（Blattella germanica）的腸道菌群進(jìn)行分析，結(jié)果表明，抗性品系和敏感品系的德國小蠊的腸道菌的圖譜存在差異，每個電泳條帶的數(shù)量和遷移率各不相同，說明兩種品系的德國小蠊腸道菌群存在差異，推測昆蟲體內(nèi)微生物群落變化與其抗藥性有關(guān)。Xia等［27]發(fā)現(xiàn)小菜蛾（P.xylostella）中腸細(xì)菌在抗性品系與敏感品系存在差別，推測腸道細(xì)菌菌群在抗藥性上發(fā)揮著重要作用；第三種是昆蟲內(nèi)共生菌體內(nèi)解毒酶的活性升高從而使昆蟲抗藥性增強(qiáng)，如李娜等［28]研究發(fā)現(xiàn)褐飛虱（Nilaparvata lugens）共生菌抗吡蟲啉菌株體內(nèi)羧酸酯酶、多功能氧化酶活性明顯高于敏感菌株，之后將抗感吡蟲啉褐飛虱共生菌菌株接種在含不同濃度吡蟲啉的培養(yǎng)基中，對褐飛虱抗吡蟲啉菌株和敏感性菌株的活性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)抗性菌株的解毒酶（超氧化物歧化酶和過氧化物酶）活性提高，推測褐飛虱對吡蟲啉的抗藥性與其體內(nèi)共生菌的解毒酶和抗氧化酶活性增強(qiáng)有關(guān)［29]。

2 與昆蟲抗藥性相關(guān)的共生菌類群

與昆蟲體內(nèi)抗藥性密切相關(guān)的共生菌大致分為3類：立克次氏體、細(xì)菌和酵母菌。立克次氏體的細(xì)菌中最常見是在昆蟲和節(jié)肢動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的Wolbachia，研究發(fā)現(xiàn)全球范圍內(nèi)有70%左右的昆蟲感染了此類的細(xì)菌［30]。Wolbachia被認(rèn)為是昆蟲共生菌中豐度最高、分布最廣的類群［31]。研究發(fā)現(xiàn)煙粉虱（Bemisia tabaci）中共生菌立克次氏體Rickettsia與抗藥性也有一定關(guān)系［32]；與昆蟲抗藥性有關(guān)的細(xì)菌如Burkholderia、Arsenophonus、腸球菌（Enterococcus）、沙雷氏菌（Serratia）及腸桿菌（Enterobacter）等則多數(shù)的存在于半翅目、蜚鐮目、鱗翅目和鞘翅目等某些昆蟲的體內(nèi)［13，23，26-27]；類酵母則主要存在于半翅目如灰飛虱、褐飛虱等昆蟲的體內(nèi)［29-33]。

3 昆蟲共生菌抗藥性研究進(jìn)展

昆蟲體內(nèi)的一些共生菌具有降解殺蟲劑的能力［34-35]和提高昆蟲對外源物質(zhì)的解毒能力［36-37]。最早是在蘋果實(shí)蠅（Rhagoletis pomonella）上發(fā)現(xiàn)共生菌與抗藥性之間存在一定的關(guān)系，蘋果食蠅體內(nèi)一種專性共生菌假單胞菌Pseudomona能夠降解敵敵畏、對硫磷、狄氏劑、二嗪農(nóng)和西維因，使其在蘋果實(shí)蠅上的防治效率降低［38]。昆蟲共生菌抗藥性的研究主要集中在鱗翅目、半翅目、鞘翅目、蜚蠊目、雙翅目的昆蟲。

周文慧等［39]采用胚胎顯微注射技術(shù)，將一種高致病性共生菌一種高毒的Wolbachia品系wPopcorn注射到二化螟（Chilo suppressalis）的早期胚胎內(nèi)并使其表達(dá)活性，研究了Wolbachia與二化螟的抗藥性之間的關(guān)系。結(jié)果表明感染W(wǎng)olbachia后二化螟增強(qiáng)了其抗藥性。Wolbachia的相對含量與二化螟抗藥性之間也存在著正相關(guān)關(guān)系，即Wolbachia密度越高，二化螟的抗藥性就越強(qiáng)。Xia［40]用從小菜蛾腸道內(nèi)獲得的腸球菌、腸桿菌、沙雷氏菌對清除了腸道微生物的小菜蛾進(jìn)行飼喂，同時將這幾種菌進(jìn)行毒死蜱降解實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這幾種菌均能對毒死蜱產(chǎn)生降解作用，但是只有飼喂腸球菌的小菜蛾抗性得到了提升，他認(rèn)為腸道微生物可能存在除直接參與宿主昆蟲體內(nèi)毒素降解之外的其他方式。

目前從飛虱體內(nèi)成功分離培養(yǎng)并鑒定的類酵母共生菌有4種，包括由張環(huán)鋒等［41]利用卵塊離體培養(yǎng)法分離得到嗜鹽梗孢酵母（Sterigmatomyces halophilus）、 解 脂 假 絲 酵 母（Yarrowia lipolytica），Hughes等［42]在YM培養(yǎng)基上培養(yǎng)的假絲酵母屬酵母Candidasp.和Pang等［43]在YM培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)的類假絲酵母（Candida-like），前3種都是從褐飛虱體內(nèi)分離得到的，后一種是在甘蔗扁角飛虱體內(nèi)中分離的。褐飛虱體內(nèi)的內(nèi)共生菌主要是類酵母菌，李娜等［28]通過前期利用“卵塊離體培養(yǎng)法”成功地培養(yǎng)出褐飛虱類酵母共生菌進(jìn)行抗吡蟲啉解脂酶活性實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)褐飛虱體內(nèi)解脂假絲酵母共生菌對吡蟲啉的抗藥性與其體內(nèi)羧酸酯酶、多功能氧化酶活性增強(qiáng)有關(guān)?；绎w虱（Laodelphax striatellus）體內(nèi)也存在著多種共生菌，如共生菌Wolbachia和類酵母菌等［44-45]，Wolbachia可提高灰飛虱宿主的生殖能力，使其子代數(shù)顯著增多，類酵母共生菌可以為灰飛虱提供氨基酸和固醇類等營養(yǎng)物質(zhì)［46]。曹偉等［33]檢測出灰飛虱對不同殺蟲劑的敏感性不同，首次從灰飛虱體內(nèi)發(fā)現(xiàn)P. anomala（異常畢赤酵母）并成功離體培養(yǎng)，通過對P. anomala不同殺菌劑敏感性分析，研究了不同殺菌劑對灰飛虱及其類酵母共生菌的影響，并將抑制效果顯著的殺菌劑與殺蟲劑復(fù)配，降低了殺蟲劑的使用濃度，同時提高了灰飛虱的防治效果，為灰飛虱的防治提供新思路。同時qPCR檢測結(jié)果表明，灰飛虱體內(nèi)3種共生菌Hypomyces chrysospermus，季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliennondii）和異常畢赤酵母（P. anomala）的數(shù)量在使用殺菌劑后顯著降低，灰飛虱的死亡率與體內(nèi)類酵母共生菌的數(shù)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，進(jìn)一步說明了內(nèi)共生菌在其抗藥性方面發(fā)揮一定作用。也有研究發(fā)現(xiàn)高溫處理灰飛虱，其體內(nèi)的共生菌會減少，最終會導(dǎo)致其耐藥性減弱［47]。Li等［48]發(fā)現(xiàn)Wolbachia和Rickettsia與昆蟲的抗藥性有關(guān)。通過研究小型褐飛虱（Ladellphax striatellus，SBPH）噻嗪酮抗性品系（BR）與易感品系（BS）接觸噻嗪酮之后內(nèi)共生菌感染發(fā)生率還研究了BR的Wolbachia被清除后，其對噻嗪酮的敏感性。結(jié)果表明，BR和BS的Wolbachia感染發(fā)生率均為100%，但Wolbachia密度BR明顯高于BS，BR的沙雷氏菌感染發(fā)生率和沙雷氏菌與Wolbachia的雙重感染發(fā)生率明顯高于BS。當(dāng)BR的Wolbachia被清除后，其對噻嗪酮的敏感性增加。結(jié)果表明，沙雷氏菌和Wolbachia感染可能改善SBPH對噻嗪酮的耐藥性。

根據(jù)陳露等［32]的研究報(bào)道，內(nèi)共生菌Rickettsia、Candidatus Portiera、Candidatus Hamiltonella、Prevotella等在煙粉虱Bemisia tabaci的新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉抗性品系中明顯多于敏感品系，這可能與煙粉虱對吡蟲啉的抗性有關(guān)；在對保幼激素類似物殺蟲劑吡丙醚的抗性品系中，Candidatus Hamiltonella-OTU7、Candidatus Portiera-OTU5、Candidatus Portiera-OTU190、Rickettsia-OTU4、Rickettsia-OTU2的數(shù)量明顯多于敏感品系，這些內(nèi)共生菌可能與煙粉虱對該類藥物的抗性有關(guān)。Kontsedalov等［49]的研究也表明煙粉虱體內(nèi)的共生菌Rickettsia可以有效地減弱吡丙醚對煙粉虱的毒殺效果。楊義婷［50]研究發(fā)現(xiàn)Rickettsia bellii也可以提高煙粉虱的抗藥性。

黃彥娜［51]通過16S rDNA測序及熒光定量PCR分析，表明抗性禾谷緣管蚜種群中布赫納氏菌屬Buchner的表達(dá)量顯著高于敏感品系，推斷禾谷緣管蚜體內(nèi)的初生共生菌Buchnera與禾谷緣管蚜的抗藥性可能存在某種關(guān)聯(lián)。Kikuchiy等［23]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)共生菌伯霍爾德桿菌Burkholderia可以使點(diǎn)蜂緣蝽對殺螟松的抗藥性增強(qiáng)，當(dāng)土壤中殺螟松含量上升時，具有分解能力的Burkholderia便在土壤中富集，且在富集土壤中生長的點(diǎn)蜂緣蝽能夠與具有抗性的Burkholderia建立共生關(guān)系，使宿主獲得對殺螟松的抗性。Xu等［52]研究表明南部長蝽Blissus insularis對殺蟲劑的抗藥性與腸道內(nèi)共生菌有一定關(guān)系。煙草甲Lasioderma serricorne體內(nèi)的類酵母共生菌可以直接分解煙堿［53]，并且可以產(chǎn)生水解酶，對食物中的有毒物質(zhì)進(jìn)行代謝［46]，也可以產(chǎn)生多種解毒酶如乙酰膽堿酯酶，對廣譜性的殺蟲劑具有解毒作用［54]。劉浩［26]選用不同種類殺蟲劑通過藥膜法對德國小蠊進(jìn)行抗藥性分析，研究發(fā)現(xiàn)去除腸道菌的德國小蠊的抗藥性低，說明腸道微生物對德國小蠊的抗藥性產(chǎn)生了一定的影響。有研究表明感染W(wǎng)olbachia可以顯著提高果蠅對噻嗪酮等殺蟲劑的抗藥性［8]。Cheng等［55]從桔小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalis）抗性品系體內(nèi)分離培養(yǎng)得到檸檬酸桿菌（Citrobactersp.，CF-BD），并通過比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CF-BD中的磷酸水解酶基因在敵百蟲存在時高表達(dá)，從而證明CF-BD在B. dorsalis產(chǎn)生殺蟲劑抗性過程中起到關(guān)鍵作用。洪善超等［56]通過實(shí)時定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）測定并比較淡色庫蚊（Culex pipiens pallens）溴氰菊酯抗性和敏感品系中Wolbachia表達(dá)差異，結(jié)果顯示抗性品系比敏感品系Wolbachia表達(dá)量高，研究發(fā)現(xiàn)Wolbachia表達(dá)水平和淡色庫蚊溴氰菊酯抗性間存在相關(guān)性。還有研究發(fā)現(xiàn)腸道細(xì)菌參與了斯氏按蚊Anopheles stephensi對有機(jī)磷殺蟲劑的降解［57]。

4 展望

研究表明，昆蟲共生菌不僅可以為宿主提供食物中缺乏的必需營養(yǎng)物質(zhì)，協(xié)助宿主的營養(yǎng)代謝，而且也可以增強(qiáng)宿主的抗逆性、抗藥性等。昆蟲體內(nèi)共生菌介導(dǎo)的宿主抗藥性產(chǎn)生的細(xì)菌類群、抗性機(jī)理等呈現(xiàn)出多樣性和復(fù)雜性。由于許多共生菌無法體外培養(yǎng)，某種程度上限制了其功能和互作機(jī)理的研究，但隨著分子生物學(xué)技術(shù)特別是宏基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，昆蟲共生菌的功能研究將會有明顯突破。以果蠅、家蠶為代表的模式昆蟲的基因組測序相繼完成，使昆蟲抗藥性研究進(jìn)入了組學(xué)時代。今后更需要眾多學(xué)科領(lǐng)域的交叉滲透研究，使昆蟲抗藥性的分子機(jī)制得到更深入闡釋，為病蟲害的監(jiān)測防治、新型殺蟲劑的研制以資源昆蟲抗性品系選育提供科學(xué)有效的理論指導(dǎo)。昆蟲共生菌介導(dǎo)的抗藥性治理對于農(nóng)產(chǎn)及品質(zhì)量控制以及環(huán)境保護(hù)等具有重要意義，也為生物防治提供了新方法新思路。目前，對于昆蟲內(nèi)共生菌抗藥性機(jī)制沒有很明確的闡釋，昆蟲體內(nèi)存在多種酶，而抗藥性與解毒酶的活性有關(guān)，共生菌的存在是否會導(dǎo)致酶活改變，共生菌是否會影響昆蟲體內(nèi)抗藥基因的表達(dá)水平等都需要進(jìn)一步探究。隨著研究的深入，昆蟲共生菌是如何介導(dǎo)對不同類型殺蟲劑抗性的產(chǎn)生，以及如何利用這些共生菌達(dá)到防治害蟲、保護(hù)益蟲的目的會是未來研究的重點(diǎn)內(nèi)容，同時研究結(jié)果也會為研究昆蟲-微生物的互作奠定研究基礎(chǔ)。