章帥文，楊 勇，李昆太

角蛋白酶產(chǎn)生菌及其應(yīng)用研究進(jìn)展

章帥文，楊 勇，李昆太*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室，江西 南昌 330045）

角蛋白作為羽毛的主要成分，由于分子中存在大量相互交聯(lián)的二硫鍵、氫鍵和鹽鍵等化學(xué)鍵，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定難以有效降解，給環(huán)境造成了極大的壓力。利用微生物代謝所產(chǎn)的角蛋白酶對其進(jìn)行降解，相較于物理化學(xué)水解的方法更加高效、經(jīng)濟(jì)和環(huán)保，引起了國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。在對比分析角蛋白物理、化學(xué)、生物等降解法的基礎(chǔ)上，對角蛋白酶的來源、理化性質(zhì)和應(yīng)用研究等進(jìn)行了綜述，以期為角蛋白酶相關(guān)研究提供參考。

角蛋白；羽毛；微生物；角蛋白酶

隨著生活質(zhì)量的不斷提高，人們對雞、鴨、鵝等家禽的需求量日趨增大，與之伴隨的羽毛處理問題也接踵而至[1]。由于羽毛質(zhì)量占活禽總質(zhì)量的5%~7%，且目前人們對于羽毛的利用率還處于較低水平，導(dǎo)致全球每年雞毛廢棄物高達(dá)850萬t，給世界各地對于羽毛的處理帶來巨大的挑戰(zhàn)[2]。當(dāng)前對于羽毛的處理方式主要是通過填埋或焚燒，這兩種方式會造成環(huán)境污染及危害人體自身健康等一系列問題[3]。羽毛近90%是由角蛋白組成的，可以作為一種具有潛在價值的生物資源，不僅可以降低環(huán)境壓力，還可以實現(xiàn)該資源的實際應(yīng)用價值[4]。本文就角蛋白酶產(chǎn)生菌及角蛋白酶的應(yīng)用等進(jìn)行了歸納總結(jié)，以期為角蛋白酶的相關(guān)研究提供參考。

1 角蛋白組成及主要分解方式

由于角蛋白由大量的二硫鍵、氫鍵、鹽鍵等鍵相互交連，導(dǎo)致其分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，不溶于水、弱酸、有機(jī)溶劑、胰蛋白酶或胃蛋白酶等常見蛋白水解酶[5]。角蛋白在自然界中豐富存在，它是繼纖維素和甲殼素之后第三大產(chǎn)量的聚合物[6]。角蛋白作為一種纖維性、頑固性的結(jié)構(gòu)蛋白，可以作為保護(hù)層，使動物有效的對抗非生物脅迫和生物攻擊。

二硫鍵的含量是決定不同角蛋白抗性和穩(wěn)定性的主要因素。從該意義上講，角蛋白可以根據(jù)硫（半胱氨酸）含量分為硬角蛋白和軟角蛋白，硬角蛋白主要存在于羽毛、頭發(fā)、羊毛等中，軟角蛋白主要存在于角質(zhì)層中[7]。另外，角蛋白按其二級結(jié)構(gòu)也可分為α-角蛋白（α-螺旋）和β-角蛋白（β-折疊）。α-角蛋白與β-角蛋白在不同的物質(zhì)中存在差異，如：在毛發(fā)纖維中α-角蛋白的含量占50%~60%，β-角蛋白只含有少量的一點，尤其是在毛發(fā)角質(zhì)層中更為突出；然而羽毛的α-角蛋白占41%、β-角蛋白占38%，與毛發(fā)明顯存在差異。與α-角蛋白相比，β-角蛋白的構(gòu)象更為廣泛，更容易受到化學(xué)藥品的作用[8]。

目前，角蛋白的處理主要通過物理、化學(xué)和生物等的方式進(jìn)行。物理方法主要采用高溫高壓的水解方式，水解時的溫度和壓強(qiáng)高達(dá)220 °C、2.2 MPa。盡管該方法操作簡單，但它不僅會分解如胱氨酸和半胱氨酸等氨基酸，造成營養(yǎng)成分的破壞，而且還需要投入大量的動力成本，造成能量的浪費(fèi)[9]?；瘜W(xué)方法主要通過強(qiáng)酸（如鹽酸和硫酸）、強(qiáng)堿（如氫氧化鈉和氫氧化鈣）水解角蛋白，以達(dá)到破壞角蛋白中穩(wěn)定二硫鍵結(jié)構(gòu)的目的[10]。酸性水解效率很高，但會導(dǎo)致一些氨基酸的損失，如色氨酸；堿性水解雖然水解較慢、不完全，但氨基酸的損失較低?；瘜W(xué)水解過程的產(chǎn)量取決于pH、溫度和反應(yīng)時間，以及所用酸或堿的類型和濃度?；瘜W(xué)水解通常需要加熱來輔助，以確保高產(chǎn)量，但高溫會增加氨基酸的破壞程度[11]。

生物降解主要是利用微生物產(chǎn)生的角蛋白酶，對角蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)分解。相對于物理和化學(xué)水解方法，微生物降解角蛋白無需高溫高壓的條件，也無各種有害化學(xué)試劑的添加。即可以減少對能源的浪費(fèi)，也可以減少對環(huán)境的危害，是對角蛋白降解最具有潛力的降解方式[12]。

2 角蛋白酶的來源、分類及理化性質(zhì)

角蛋白酶是一種具有廣譜性底物特性的蛋白酶，可降解如膠原蛋白、牛乳清蛋白、酪蛋白等可溶及不可溶性蛋白質(zhì)。特別是其可降解天然的角蛋白，形成可溶性氨基酸和多肽，并且反應(yīng)條件溫和，相較于傳統(tǒng)的蛋白酶有著顯著優(yōu)勢[13-14]。角蛋白酶的發(fā)現(xiàn)，讓人們找到了一種理想的，將角蛋白酶廢棄物變廢為寶的新途徑。

2.1 角蛋白酶的來源

土壤中含有豐富的微生物存在，80%~90%土壤的生物過程都有微生物參與。作為主要來源于微生物生長代謝中的角蛋白酶，其來源與分布十分廣泛，在細(xì)菌、放線菌和真菌中均有角蛋白酶產(chǎn)生菌被發(fā)現(xiàn)[15-16]。目前發(fā)現(xiàn)的角蛋白酶產(chǎn)生菌多來源于細(xì)菌，如：短芽孢桿菌（）[17]、嗜麥芽窄食單胞菌（）[18]、粘金黃桿菌（）[19]和假單胞菌（sp.）[20]等。由于細(xì)菌的生長周期快、產(chǎn)角蛋白酶活性高，加之篩選出的角蛋白酶產(chǎn)生菌芽孢桿菌安全系數(shù)高，因此對它的研究一直是國內(nèi)外熱點話題，其中產(chǎn)角蛋白酶的桿菌類細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)最多[21]。Abdel-Fattah等[22]篩選出一株地衣芽孢桿菌（） ALW1，該菌在無氧化還原系統(tǒng)中對將羽毛的降解率為63%。劉標(biāo)等[23]篩選出一株凝結(jié)芽孢桿菌（），發(fā)現(xiàn)其對豬毛角蛋白降解率為77.3%。

真菌作為最早被發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生角蛋白酶的菌，Ward在1899年就報道了在馬爪甲團(tuán)囊菌（）中分離到角蛋白酶[24]。此外，真菌中主要是皮膚類真菌產(chǎn)生角蛋白酶，如紅色毛癬菌（）[25]、須毛癬菌（）[26]和石膏樣小孢子菌（）[27]等。但非皮膚真菌也存在能產(chǎn)生角蛋白酶的菌，如金色孢菌屬（）[28]、鐮刀霉菌屬（）[29]和青霉菌屬（）等[30]。黃曲霉（）之前一直是被認(rèn)為在真菌中產(chǎn)生角蛋白酶最有研究價值的菌，但是該菌會產(chǎn)生有毒的黃曲霉毒素，限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用[31]。放線菌同樣存在對角蛋白具有降解能力的菌株存在，但主要是鏈霉菌屬()，如：桑氏鏈霉菌（）[32]、微菌核鏈霉菌（）[33]、黃白鏈霉菌（）[34]等。上述微生物可在養(yǎng)殖場及屠宰場附近的土壤中或者動物的表皮毛發(fā)上采集到，當(dāng)使用粉狀角蛋白作為培養(yǎng)基中的唯一碳氮源，能夠篩選產(chǎn)角蛋白酶的微生物?？梢酝ㄟ^挑選出具有較大水解圈的單菌落進(jìn)行發(fā)酵測試，來獲得其中高產(chǎn)角蛋白酶的菌株。

2.2 角蛋白酶的分類

根據(jù)角蛋白酶活性中心的分類，可將其分為絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶三大類[35]。其中絲氨酸蛋白酶類的角蛋白酶的數(shù)量最多、應(yīng)用最廣，主要產(chǎn)自細(xì)菌，而三聯(lián)催化體Asp、His、Ser分別存在于這些微生物絲氨酸蛋白酶所在的多個高度保守區(qū)域，這對于角蛋白的水解起到了至關(guān)重要的作用；金屬蛋白酶類的角蛋白酶的分布、來源最廣，在細(xì)菌、放線菌和真菌中均有報道，其活性中心含有的Zn2+、Ca2+等二價金屬離子，對于其催化功能起著重要作用。而一些角蛋白酶同時屬于絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶，同時擁有以上兩類酶的性質(zhì)。天冬氨酸蛋白酶類的角蛋白酶目前只在人體腐生真菌白色念珠菌（）中發(fā)現(xiàn)，其活性中心含天冬氨酸，這種蛋白酶是白色念珠菌感染人體皮膚的作用因子[36]。

2.3 角蛋白酶的理化性質(zhì)

角蛋白酶是微生物經(jīng)過環(huán)境誘導(dǎo)后產(chǎn)生的胞外酶，利用降解的蛋白底物為其自身生長提供營養(yǎng)成分，且微生物生長環(huán)境以及種屬不同，其分泌的角蛋白酶在各種性質(zhì)上也會存在明顯差異。

2.3.1 分子量 由于角蛋白酶的來源及產(chǎn)生環(huán)境不同，導(dǎo)致其分子量存在較大差異，從18~240 ku均有發(fā)現(xiàn)，但普遍都在30~60 ku。如在短小芽孢桿菌（）中，可以分離到分子量為30 ku的絲氨酸角蛋白酶[37]。分子量較大的為復(fù)合酶，其分子量高達(dá)幾百ku，如玫瑰考克氏菌()經(jīng)凝膠過濾層析法可分離出分子量達(dá)到240 ku的角蛋白酶[38]。

2.3.2 最適反應(yīng)條件 角蛋白酶作為酶的一種，其與大部分酶一樣，最適反應(yīng)的pH以中性到堿性居多，一般pH為7~10。如短小芽孢桿菌所產(chǎn)生角蛋白酶的最適pH為9.0，地衣芽孢桿菌在pH為7.0~9.0時都有較好的活性。也有在酸性條件下角蛋白酶具有最佳反應(yīng)pH，但多為人體腐生真菌所產(chǎn)角蛋白酶，如須毛蘚菌所產(chǎn)生角蛋白酶的最適pH為5.5，白色假絲酵母（）的pH為4.0，這可能與人體的皮膚環(huán)境為弱酸性有關(guān)[39-42]。

角蛋白酶的最適反應(yīng)溫度一般在40~60 ℃，如微桿菌屬（）的最適溫度在55 ℃，而一些角蛋白酶類在較低或較高的溫度時也表現(xiàn)出極佳的穩(wěn)定性，如寡養(yǎng)單胞菌（sp.）D1為的最適溫度20 ℃，海島閃光桿菌（）AW-1的膜結(jié)合角蛋白酶的最適溫度高達(dá)100 ℃，都有著相當(dāng)高的工業(yè)應(yīng)用價值[43]。

2.3.3 底物特異性 角蛋白酶不僅對角蛋白具有誘導(dǎo)水解效果，它還對一些可溶性蛋白質(zhì)（酪蛋白、明膠和牛血清白蛋白等）和不可溶性蛋白質(zhì)（羽毛、羊毛和指甲等）具有水解效果。但存在底物單一的，只對一種底物具有特異性，如雞毛癬菌角蛋白酶只能降解鳥類羽毛，對其它種類的角蛋白較難降解；而一些人體腐生真菌主要降解的底物是人角質(zhì)層和指甲，幾乎不能降解動物毛發(fā)，這可能是長時間的環(huán)境選擇進(jìn)化所致。

2.3.4 特殊化學(xué)環(huán)境影響 不同的金屬離子對角蛋白酶的影響具有差異性，Ca2+、Mg2+對多數(shù)角蛋白酶的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用，而Ni2+、Hg2+、Cd2+則對多數(shù)角蛋白酶具有抑制作用。此外，二硫蘇糖醇（DTT）、巰基乙醇（β-Me）等還原劑能夠協(xié)助角蛋白酶加速角蛋白的降解，而含二硫鍵的角蛋白酶在以其他含少量或者不含二硫鍵的蛋白質(zhì)為底物時，需要注意其解酶二硫鍵的負(fù)效應(yīng)。

2.4 角蛋白酶的作用機(jī)制

角蛋白酶水解角蛋白的過程，是將角蛋白的高級結(jié)構(gòu)水解成氨基酸和多肽等次級結(jié)構(gòu)。由于在此過程中隨著不同微生物分泌的角蛋白不同，水解過程也存在著一定的差異。國內(nèi)外學(xué)者對于角蛋白酶的作用機(jī)制尚未完全研究清楚，但普遍認(rèn)為角蛋白的降解主要分為三步。變性作用：角蛋白酶中的二硫鍵還原酶將胱氨酸（S-S）還原成半胱氨酸（-SH），使角蛋白高級結(jié)構(gòu)解體而形成變性角蛋白；水解作用：在角蛋白變性后，角蛋白被水解成多肽、寡肽和游離氨基酸；轉(zhuǎn)氨基作用：最后在轉(zhuǎn)氨基的作用下降多肽等物質(zhì)水解成氨氣和硫化物，從而使角蛋白徹底分解[44]。

3 角蛋白酶的應(yīng)用前景

角蛋白酶是一種具有廣泛應(yīng)用前景的酶，在我們的日常生活中隨處可見其相關(guān)產(chǎn)品，特別是在醫(yī)學(xué)、飼料、皮革等方向都扮演著重要角色。

3.1 角蛋白酶在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用

在醫(yī)藥行業(yè)，角蛋白酶具有許多不同的用途，它可以用來去除角質(zhì)化的皮膚、祛除結(jié)痂、制備治療皮膚病藥劑等。由于動物體的角質(zhì)層主要是由膠原蛋白和角蛋白組成的，其結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，在保護(hù)皮膚的同時，也會妨礙皮膚對藥物的吸收，給治療皮膚疾病帶來極大難度。隨著對皮膚疾病研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)在外敷藥物中添加可提高皮膚通透性的角蛋白酶，會促進(jìn)藥物滲透進(jìn)皮膚，使該藥直接在病源體上起作用，從而提高藥物療效[45]。

3.2 角蛋白酶在飼料行業(yè)的應(yīng)用

畜牧行業(yè)常因動物宰殺，而產(chǎn)生大量的廢棄羽毛，對于這些羽毛，主要通過掩埋、焚燒的方式處理，或直接制成羽毛粉作為動物飼料。然而焚燒和掩埋不僅會污染環(huán)境，影響市容市貌，還會產(chǎn)生病原菌危害人畜健康。將廢棄羽毛直接制成動物飼料，動物對其的消化能力不強(qiáng)，導(dǎo)致利用率大大降低。工業(yè)生產(chǎn)中可通過在該飼料中通過添加角蛋白酶或其產(chǎn)生菌的方式，使動物對該飼料的吸收率得到提高，從而提高飼料的營養(yǎng)價值。作為含有豐富氨基酸的角蛋白，可利用該特性，在食品中添加角蛋白的降解產(chǎn)物，使食品的營養(yǎng)價值得到提高[46]。

在家禽加工廠，羽毛作為廢物副產(chǎn)品被大量生產(chǎn)，每年在全球范圍內(nèi)可達(dá)到數(shù)百萬噸。由于羽毛結(jié)構(gòu)中幾乎是純角蛋白（90%或更高），它們代表了一種潛在的、可替代的動物飼料的飲食成份。然而，羽毛廢料在有限的基礎(chǔ)上被用作于動物飼料的膳食蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑，因傳統(tǒng)的加工方法需要大量的能量，并會產(chǎn)生消化率差和營養(yǎng)質(zhì)量可變的產(chǎn)品。

3.3 角蛋白酶在皮革行業(yè)的應(yīng)用

在皮革行業(yè)中，對動物皮膚進(jìn)行脫毛處理，常用的方法是使用硫化鈉脫毛工藝[47]。該方法主要是通過破壞角蛋白的雙硫鍵，破壞角質(zhì)層中角蛋白的穩(wěn)定性，以達(dá)到脫毛的效果，該方法不僅會產(chǎn)生大量的廢液污染環(huán)境，還會影響皮革的品質(zhì)。在皮革行業(yè)使用角蛋白酶進(jìn)行脫毛時，不會對皮革中的膠原蛋白造成損傷[48]。根據(jù)這一特點，使用角蛋白酶脫毛比常規(guī)化學(xué)方法進(jìn)行脫毛，具有對環(huán)境污染小、皮革品質(zhì)高的優(yōu)點。Nadia等[49]從特基拉芽孢桿菌（）Q7分離出的細(xì)胞外角蛋白酶KERQ7，通過分析其的理化性質(zhì)，判斷出該酶在皮革加工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用前景。

3.4 角蛋白酶在美容行業(yè)的應(yīng)用

角蛋白由于可以被角蛋白酶誘導(dǎo)水解，故可以將角蛋白酶添加到護(hù)膚品中，去除皮膚中老死的細(xì)胞、多余的角質(zhì)層，提高皮膚的通透性，使護(hù)膚更好的進(jìn)入皮膚的深層，作用于皮膚深層細(xì)胞，達(dá)到護(hù)膚的作用。做成的護(hù)膚品也可以用來清除疤痕，達(dá)到美容的作用。

3.5 角蛋白酶在其它行業(yè)的應(yīng)用

角蛋白酶不僅可以被應(yīng)用于以上幾個行業(yè)中，它還可作為降解劑、添加劑、清洗劑等出現(xiàn)在我們的日常生活中。例如，富含角蛋白的廢棄物被角蛋白酶降解可以用來制備生物氫[50]；在洗滌劑中添加角蛋白酶可以清洗富含角蛋白的廢料排水溝，提高洗滌劑的洗滌能力[51]；被朊病毒污染的手術(shù)器械可以用角蛋白制成的清洗劑進(jìn)行清洗[52]。

4 總結(jié)與展望

作為羽毛中主要成分的角蛋白，由于其對各種化學(xué)試劑和酶具有很高的抵抗力，導(dǎo)致羽毛一直未能被充分利用。盡管多年國內(nèi)外學(xué)者一直致力于對水解角蛋白的研究，但角蛋白中含有大量的二硫鍵和氫鍵，以及疏水鍵相互作用和緊密堆積的角蛋白微纖維，這些物質(zhì)高度交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)不溶于水、弱堿和弱酸的溶液以及大多數(shù)有機(jī)溶劑。傳統(tǒng)水解角蛋白的方法有物理和化學(xué)方法，這兩種水解方式不僅會對設(shè)備產(chǎn)生腐蝕、產(chǎn)生大量的工業(yè)廢水污染環(huán)境，還存在破壞角蛋白內(nèi)部氨基酸的結(jié)構(gòu)，造成營養(yǎng)流失的缺點。通過大量研究發(fā)現(xiàn)，利用微生物代謝所產(chǎn)生的角蛋白酶水解角蛋白，可以有效地減少傳統(tǒng)水解帶來的缺點。

角蛋白酶作為一種水解性蛋白酶，它能高效的將角蛋白水解成氨基酸和多肽。在水解角蛋白時，其具有反應(yīng)條件溫和、能源浪費(fèi)率低和對設(shè)備要求低等優(yōu)點。它還是一種具有廣譜水解性的酶，它不僅可以降解角蛋白，還能對膠原蛋白、牛乳清蛋白和酪蛋白等蛋白起到降解作用。基于上述的優(yōu)點，角蛋白酶近年來被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、皮革和食品等行業(yè)上。

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Research Progress of Keratinase Production Strain and Its Application

ZHANG Shuai-wen, YANG Yong, LI Kun-tai*

（Institute of Applied Microbiology/College of Bioscience and Bioengineering, Jiangxi Agricultural University, Nangchang 330045, China）

The keratin is a major component of feathers, which is very stable and difficult to be degraded because of the existence of a large number of disulfide bonds, hydrogen bonds and salt bonds intersecting with each other in the molecular structure, and thus causes great pressure to the environment. Compared with the methods of physical and chemical hydrolysis, the advantage of higher efficiency, economy and environmental protection of the hydrolysis produced by microbial metabolism attracted the attention of scholars. In order to provide references for relating researches of the keratin, this article reviewed the properties and application of the keratin by comparing and analyzing the degradation methods.

keratin; feather; microbial; keratinase

http://xuebao.jxau.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-3704.2019.03.39

S816.4

A

2095-3704（2019）03-0179-07

2019-08-30

江西省青年科學(xué)家培養(yǎng)計劃項目（20142BCB23025）

章帥文（1995—），男，碩士生，主要從事植物病原真菌生物防治研究，853433179@ qq.com；

李昆太，教授，博士，atai78@ sina.com。

章帥文, 楊勇, 李昆太. 角蛋白酶產(chǎn)生菌及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2019, 42(3): 179-185.