李 捷，吳 穎

(國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作四川中心，四川 成都 610213)

“酶制劑”是一個已有半個多世紀(jì)歷程的產(chǎn)業(yè)，其完整的概念不僅僅包括酶制劑相關(guān)產(chǎn)品，同樣還包括酶制劑的應(yīng)用[1]。如今，酶制劑已成為一個具有高競爭力的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)，并仍保持著高速的發(fā)展態(tài)勢。

諾維信是全球領(lǐng)先的生物技術(shù)公司，迄今為止，諾維信擁有約7000多項有效專利、正在申請的專利和專利許可。因此，筆者重點分析了諾維信在華酶制劑專利申請量趨勢、主要酶產(chǎn)品“蛋白酶”的技術(shù)發(fā)展路線，以期為我國生物酶制劑創(chuàng)新主體在專利布局方面提供有價值的信息參考。

本文利用國家知識產(chǎn)權(quán)局自主開發(fā)的S系統(tǒng)，包括CNABS和SIPOABS數(shù)據(jù)庫進行了檢索，在檢索過程中采用分類號和關(guān)鍵詞相結(jié)合的方式進行。本文重點分析了申請量趨勢、主要酶產(chǎn)品"蛋白酶"的技術(shù)發(fā)展路線。

1 申請量趨勢分析

諾維信在中國最早的發(fā)明專利申請于1991年提交。之后專利申請量總體呈穩(wěn)步上升趨勢，期間偶有下降，在2012～2015年期間申請量明顯上升，2015年時達到峰值(84件)。在建設(shè)生態(tài)文明的大政方針的指引下，諾維信公司與中國積極合作，并就環(huán)境友好型產(chǎn)品的技術(shù)加快了進入中國的步伐。2016～2018年的數(shù)據(jù)因一部分的未公開入庫，有部分缺失，不能真實反映其申請量。

1.1 技術(shù)領(lǐng)域分析

為了了解和分析諾維信公司酶制劑相關(guān)的研究熱點以及在華布局的技術(shù)熱點，對檢索得到的相關(guān)專利申請的主分類號進行了統(tǒng)計與分析，諾維信在華申請量最多的分類號集中在C12N小類下的3個大組分類號：C12N9/00(酶；酶原；其組合物，制備、活化、抑制、分離或純化酶的方法)占78.46%、C12N15/00(突變或遺傳工程；遺傳工程涉及的DNA或RNA，載體(如質(zhì)粒)或其分離、制備或純化；所使用的宿主)占14.91%以及C12N1/00(微生物本身，如原生動物；及其組合物)占6.02%。其中，C12N9/00分類號釋義：酶；酶原；其組合物，制備、活化、抑制、分離或純化酶的方法。

其中，有關(guān)酶、其組合物、制備、活化、抑制、分離或純化酶的方法的專利申請量占諾維信在華專利申請量的78.46%，這與諾維信的研發(fā)重心和生產(chǎn)銷售主打產(chǎn)品是一致的。

1.2 重要技術(shù)專利情況

筆者還統(tǒng)計了諾維信蛋白酶制劑產(chǎn)品相關(guān)在華申請的技術(shù)主題類型，并根據(jù)這些主題類型對應(yīng)申請數(shù)量的多少進行了排名。其中申請量最多的技術(shù)主題是方法，其次是組合物和蛋白酶及制劑。經(jīng)查看相關(guān)申請文件發(fā)現(xiàn)，這些申請大部分都是圍繞諾維信的主要業(yè)務(wù)路線進行的專利布局。諾維信公司的主要業(yè)務(wù)是通過發(fā)現(xiàn)、改良、生產(chǎn)和銷售酶制劑和微生物制劑，將其產(chǎn)品應(yīng)用于廣泛的工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，諸如洗滌劑、食品、生物能源、紡織、皮革、造紙和飼料等40多個工業(yè)加工領(lǐng)域。首先通過發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)變體或特定功能域、挖掘新的突變位點，并對其進行改造，進而產(chǎn)生新的突變體以及能夠用于工業(yè)生產(chǎn)酶的微生物，并將產(chǎn)生的蛋白酶產(chǎn)品申請專利，進而在相關(guān)組合物、添加劑(例如洗滌劑添加劑和飼料添加劑)、制備方法、用途等外圍專利進行布局。另外，諾維信公司還有部分蛋白酶相關(guān)產(chǎn)品的申請涉及表達系統(tǒng)、宿主細胞、偶聯(lián)物、綴合物等。

2 蛋白酶制劑專利技術(shù)路線分析

酶在洗滌劑工業(yè)中的使用已經(jīng)超過了30年，其中最重要的酶是蛋白酶。蛋白酶是所有種類的洗滌劑中的標(biāo)準(zhǔn)成分之一。諾維信公司的蛋白酶產(chǎn)品主要包括枯草桿菌蛋白酶、金屬蛋白酶等?？莶輻U菌蛋白酶是一個典型組的細菌絲氨酸蛋白酶，由于它們在高溫和堿性條件下的穩(wěn)定性和活性，因此被廣泛用于洗滌劑中，且成為了蛋白酶的研究熱點，例如在新洗滌劑組合物的低溫性能和開發(fā)，導(dǎo)致對新蛋白酶和其他類型的洗滌劑酶的研究燃起了新的興趣。金屬蛋白酶由于其在洗滌劑組合物中連同在洗滌過程期間的條件下的低穩(wěn)定性，是一組目前較少地應(yīng)用于洗滌工業(yè)中的蛋白酶，在商業(yè)上也并未取得較大的成功。

許多變體在不同的洗滌劑中具有提高的活性、穩(wěn)定性和溶解性，然而不同的因素使得蛋白酶的優(yōu)點有了進一步的提高。如溫度和pH等清洗條件會隨時間而發(fā)生變化，并且許多污漬在傳統(tǒng)的清洗條件下仍然難以去除。由此可見，不論蛋白酶開發(fā)的深入研究如何，對于新的、改善的蛋白酶仍然存在需求，因此，對于諾維信公司酶制劑在華申請的主要產(chǎn)品-枯草桿菌蛋白酶及金屬蛋白酶的技術(shù)路線都在一定程度上反映了諾維信公司的酶制劑領(lǐng)域在中國的布局及洗滌劑相關(guān)行業(yè)的發(fā)展方向。

2.1 枯草桿菌酶在中國申請的技術(shù)路線

1997年，諾維信公司在中國最早提出兩件關(guān)于枯草桿菌酶的專利申請，分別涉及一種枯草酶變種及組合物，與其野生型親本酶相比，這些突變體酶在任何去污劑中均表現(xiàn)出改良的洗滌效果。另一件申請同樣涉及枯草桿菌酶突變體和組合物，其提供了通過誘變一系列枯草桿菌酶的基因并在合適的宿主中表達經(jīng)誘變的基因而產(chǎn)生的酶。與其野生型母體酶相比，這些酶表現(xiàn)出增強的蛋白自身酶解穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)在特定位點上的一個或多個氨基酸殘基進行改造的枯草桿菌酶變異體與相應(yīng)的野生型相比，具有改變了的蛋白自身酶解降解模式?；镜母淖兪敲黠@位于殘基132～133(BASBPN編號)之間的自身酶解切割位點。這個蛋白自身酶解切割位點是被第一次確定為枯草桿菌蛋白酶中的初級蛋白自身酶解切割位點。1999～2000年，諾維信先后連續(xù)提交了7件申請，都是涉及在活性位點環(huán)區(qū)中具有額外氨基酸殘基的I-S1和I-S2亞組枯草桿菌酶，且上述枯草桿菌酶變體在洗滌劑中的洗滌性能相比于其親本酶都有所改良。2000～2001年，諾維信公司連續(xù)提交了4件涉及枯草桿菌酶變體及枯草桿菌酶的申請，并都表現(xiàn)出了優(yōu)良的或改進的卵污漬洗滌性能，可以應(yīng)用于如清潔或洗滌劑組合物中。在此基礎(chǔ)上，諾維信公司之后分別在2004年、2010年先后提交了3件有關(guān)具有改善的蛋漬去除能力的枯草蛋白酶的申請，上述的枯草桿菌變體都具有例如改善的能夠?qū)⒅笫斓牡包S從硬表面去除的能力。另外，對于洗滌劑的重要性能熱穩(wěn)定性的改進方面，也是諾維信公司研究的熱點之一，且該研究熱點基本上始終貫穿于其洗滌劑相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)的路線，具體來講，諾維信公司分別于2003、2006、2012年提出了3件申請。相比于熱穩(wěn)定性，另有幾件申請在其他穩(wěn)定性方面做出了改進，以適應(yīng)不同的應(yīng)用，除了前述諾維信在中國最早于1997年提出的涉及能夠增強的蛋白自身酶解穩(wěn)定性的枯草桿菌酶的申請以外，還有在2006年提交的涉及來自芽孢桿菌屬的野生型菌株的枯草桿菌酶變體的申請，該申請中公開了其發(fā)明人已分離了屬于枯草溶菌素家族的PD138樣蛋白酶亞組的新蛋白酶，其具有低溫時在洗滌劑中改進的性能；以及在2012年提交的申請中公開了發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了特定強鈣離子結(jié)合位點上具有改變的枯草桿菌酶，其中這些改變是取代或插入，導(dǎo)致變體在包含如EDTA等螯合劑的洗滌劑組合物中具有增加的穩(wěn)定性，當(dāng)與其親本蛋白酶相比較時，增加了枯草桿菌酶變體在含有如EDTA等螯合劑的溶液中的穩(wěn)定性；另外，還有兩件分別于2015年以及2017年提出的申請，都涉及一種枯草桿菌變體具有在液體洗滌劑組合物中的穩(wěn)定性增加。同時，統(tǒng)計數(shù)據(jù)中最晚于2017年提交的申請同樣涉及酶的穩(wěn)定化改進，具體地為可以使用肽醛向亞硫酸氫鹽加合物的轉(zhuǎn)化來增加在肽醛的純化中的水溶解度，這種亞硫酸氫鹽加合物本身作為枯草桿菌蛋白酶抑制劑和穩(wěn)定劑不僅是有效的，而且它還可以穩(wěn)定一種第二酶。該亞硫酸氫鹽加合物作為枯草桿菌蛋白酶抑制劑是有效的，并且在儲存過程中，它在液體洗滌劑中保持其抑制和穩(wěn)定化作用。除了洗滌劑相關(guān)產(chǎn)品以外，諾維信還在2003年提交了一件涉及到能夠在諸如洗滌劑和口腔護理產(chǎn)品中應(yīng)用的枯草桿菌酶變體和枯草桿菌酶的申請，該申請中公開了具有改變了的免疫原性的枯草桿菌酶變體和枯草桿菌酶，尤其是具有降低了的變應(yīng)原性的枯草桿菌酶變體和枯草桿菌酶。

可見，諾維信公司在中國提交的專利申請中，有關(guān)枯草蛋白酶的申請主要致力于酶在洗滌劑中洗滌性能的優(yōu)化以及穩(wěn)定性例如熱穩(wěn)定性、液體洗滌劑中的穩(wěn)定性的優(yōu)化，且隨著中國對于家居清潔不斷提高的需求并同時結(jié)合近年來對于環(huán)境保護的重視程度不斷加深，在例如去除紡織品以及硬表面的蛋漬能力加強的洗滌性能方面的酶制劑中也有較多的研究。除此以外，諾維信還同時在枯草蛋白酶的其他應(yīng)用方面例如口腔護理產(chǎn)品中也有相關(guān)的研究，這體現(xiàn)出諾維信在以洗滌劑產(chǎn)品為主線的同時兼有對蛋白酶其他相關(guān)應(yīng)用的研究。

2.2 金屬蛋白酶

金屬蛋白酶是對于其活性而言絕對需要金屬離子的蛋白水解酶。盡管一些金屬蛋白酶使用其他過渡金屬，但大多數(shù)金屬蛋白酶都是鋅依賴性的。金屬蛋白酶已經(jīng)被廣泛地用于不同工業(yè)中，像食品和釀造工業(yè)，其中一組已經(jīng)用于各種應(yīng)用中的金屬蛋白酶是M4家族金屬蛋白酶。通常，金屬蛋白酶在常規(guī)洗滌條件下以及在常規(guī)洗滌劑組合物中是非常不穩(wěn)定的，因此，金屬蛋白酶在洗滌和清潔過程中以及在洗滌劑中的使用受到很大限制。

2.2.1 金屬蛋白酶在中國申請的技術(shù)路線

1996年，諾維信公司提交了第一件有關(guān)金屬蛋白酶的申請，該申請涉及表達水平降低的金屬蛋白酶的宿主細胞和在蛋白質(zhì)產(chǎn)生中使用該宿主細胞的方法，通過該方法，金屬蛋白酶產(chǎn)生的蛋白酶解作用被明顯減小，由此改善了由所述方法獲得的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在1996年以后很長一段時期，諾維信一直沒有就金屬蛋白酶相關(guān)的產(chǎn)品或者方法等在中國提交過申請，直到2010年，提交了涉及具有減少的金屬肽酶表達、適于重組多肽產(chǎn)生的突變細胞的申請，所述的突變細菌細胞失活了該發(fā)明中推定的金屬蛋白酶能夠產(chǎn)生至少一種目標(biāo)異源多肽。之后，在2012年提交了3件有關(guān)包含金屬蛋白酶的去污劑組合物的申請，分別涉及在40℃或更低的溫度下具有增加的洗滌性能，具有熱穩(wěn)定性的金屬蛋白酶，尤其在低溫洗滌和去除蛋漬中的用途，以及進一步的改進的技術(shù)方案，具體改進為在在前申請的基礎(chǔ)上，還可能導(dǎo)致減少的洗滌時間和pH，減少去污劑用量，并且環(huán)境友好。進一步地，在2013年提交了3件申請，分別涉及包括金屬蛋白酶的洗滌劑組合物、來自脂環(huán)酸芽孢桿菌屬的金屬蛋白酶以及來自微小桿菌屬的金屬蛋白酶，研究重點依舊是在洗滌劑低溫洗滌、蛋漬去除以及環(huán)境友好方面的改進。最近的有關(guān)金屬蛋白酶的申請是2015年提交的2件申請。

3 總結(jié)與展望

從整體上看，諾維信從20世紀(jì)90年代就已經(jīng)開始就酶制劑相關(guān)領(lǐng)域在中國申請專利，尤其是在洗滌劑領(lǐng)域商業(yè)應(yīng)用最多的蛋白酶，一直是該公司研究的主要產(chǎn)品。同時，該公司除了研究改善的洗滌性能、穩(wěn)定性等的蛋白突變位點的篩選以外，還隨著中國居民生活水平的提高，對于家居清潔及其他生活用品需求水平的提高而相應(yīng)增加該方面的專利申請。

相信，隨著中國對于環(huán)境保護重視度的提高，以及與世界各國聯(lián)系的加強，不僅是越來越多的諾維信公司的酶制劑產(chǎn)品進入我們的日常生活，更多更重要的是為我們帶來更多先進的技術(shù)和理念，從而助力國內(nèi)相關(guān)企業(yè)的發(fā)展。在提高國民生活水平的同時，也為我國的環(huán)保事業(yè)做出了巨大貢獻。