張明龍，呂 瑩，劉 丹，王秀華，董 靜，趙大龍，馬洪星，鄭立紅△

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室,黑龍江齊齊哈爾 161006;2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)中心,黑龍江齊齊哈爾 161006;3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室,黑龍江齊齊哈爾 161006; 4.黑龍江省齊齊哈爾市建華醫(yī)院檢驗(yàn)科 161006;5.大慶油田總醫(yī)院普外科,黑龍江大慶 163411)

乳腺癌是威脅女性健康的常見腫瘤。最近的全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)聚焦于分析單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)與乳腺癌易感性的關(guān)聯(lián)，目前已經(jīng)確定了67個(gè)常見的乳腺癌易感基因位點(diǎn)[1-3]。人載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣(APOBEC3)基因簇編碼的蛋白質(zhì)家族含有胞嘧啶脫氨基的結(jié)構(gòu)域，能夠?qū)奏まD(zhuǎn)化為尿嘧啶，因此又稱為胞嘧啶脫氨酶基因。乳腺癌組織及APOBEC3A和APOBEC3B基因的功能學(xué)研究結(jié)果顯示，APOBEC3基因多態(tài)性與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[4-6]。本研究對(duì)黑龍江漢族乳腺癌群體的APOBEC3基因多態(tài)性進(jìn)行研究，以期發(fā)現(xiàn)APOBEC3基因與乳腺癌發(fā)病機(jī)制及臨床病理特征等生物學(xué)特性的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

表1 引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

-：無(wú)數(shù)據(jù)

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2013-2016年齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院、附屬第三醫(yī)院、建華醫(yī)院和大慶油田總醫(yī)院的標(biāo)本，其中病例組為282例乳腺癌標(biāo)本，均為無(wú)親緣關(guān)系的漢族女性，采集在化療或放療之前；對(duì)照組標(biāo)本302例，均來(lái)自于體檢中心，要求無(wú)腫瘤和癌前病變，無(wú)肝炎病毒、艾滋病毒等病毒感染史。所有標(biāo)本的采集均符合醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)的要求，所有對(duì)象簽訂知情同意書。本研究對(duì)基本信息進(jìn)行采集，包括年齡、腫瘤家族史、初潮年齡、絕經(jīng)與否；對(duì)乳腺癌組的生物學(xué)特性等信息進(jìn)行了匯總，其中包括腫瘤大小(T1～T4)、組織學(xué)分級(jí)(G1～G3)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、雌激素受體陽(yáng)性與否、孕激素受體陽(yáng)性與否及病理組織分型。

1.2方法 采用全血DNA快速提取試劑盒提取基因組DNA，并采用微量分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)，所有DNA標(biāo)本的濃度和純度需滿足后續(xù)檢測(cè)的要求。PCR：采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性多態(tài)性內(nèi)切酶技術(shù)(PCR-PFLP)對(duì)APOBEC3基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)和1個(gè)基因拷貝數(shù)變異(CNV)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，引物序列、限制性內(nèi)切酶和產(chǎn)物片段見表1，引物合成委托中美泰和生物技術(shù)公司合成?；蚍中停翰捎?%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR和酶切產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)片段長(zhǎng)度進(jìn)行判讀。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)本基本特征數(shù)據(jù)及均衡性檢驗(yàn) 共搜集584例標(biāo)本，兩組年齡、初潮年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤家族史及臨床生物學(xué)特征數(shù)據(jù)(腫瘤大小，腫瘤分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，雌激素受體和孕激素受體陽(yáng)性)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組基本特征數(shù)據(jù)信息

-：無(wú)數(shù)據(jù)

2.2平衡性校驗(yàn) 兩組各位點(diǎn)的基因型分布觀察值與期望值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。LD檢驗(yàn)結(jié)果顯示，3個(gè)SNP位點(diǎn)(rs5757402、rs17370615和rs12157810)構(gòu)成連鎖，可以構(gòu)成單倍型分析。

表3 基因型分布和等位基因頻率分布及顯性不同遺傳模式下對(duì)易感性風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)(n)

-：無(wú)數(shù)據(jù)

2.3APOBEC3基因多態(tài)性與乳腺癌易感性分析 通過對(duì)病例組和對(duì)照組的APOBEC3基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)和CNV位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，兩組間比較結(jié)果顯示rs17370615和CNV位點(diǎn)的基因頻率分布在組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；rs17370615的GA基因型頻率在組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)乳腺癌易感性O(shè)R值為1.597，CNV位點(diǎn)的Ins/Del和Del/Del基因型頻率分布在組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)乳腺癌易感性O(shè)R值分別為：2.927和1.629；顯性模型下，rs17370615和CNV位點(diǎn)在兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)乳腺癌易感性的OR值分別為1.627和1.761；單倍型CGC和CAA的頻率分布在組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)乳腺癌易感性的OR值分別為0.346和4.587，見表3、4。

表4 單倍型頻率分布及顯性遺傳模式下對(duì)易感性風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)(n)

-：無(wú)數(shù)據(jù)

2.4APOBEC3基因多態(tài)性與乳腺癌生物學(xué)特性的關(guān)聯(lián)分析 rs5757402、rs12157810和CNV位點(diǎn)的基因型和顯性模型之間的乳腺癌的臨床生物學(xué)特性(腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體和孕激素受體陽(yáng)性)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，rs17370615的基因型GA和顯性模型多態(tài)性與腫瘤分期(是否大于G1)具有明顯關(guān)聯(lián)(P<0.05)，見表5。

表5 病例組的APOBEC3基因多態(tài)性與臨床生物學(xué)特性的關(guān)聯(lián)

-：無(wú)數(shù)據(jù)

3 討 論

APOBEC3基因簇編碼的家族蛋白都含有1個(gè)胞嘧啶脫氨基結(jié)構(gòu)域，一方面具有抑制反轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞免疫功能[7]，另一方面還具有抑制內(nèi)源性的反轉(zhuǎn)座子(LINEs)的作用[8]?；贏3s的胞嘧啶脫氨基功能，可以通過對(duì)5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶的脫氨基作用，使錯(cuò)配的基因得以修復(fù)，亦使DNA發(fā)生去甲基化。同樣基于脫氨基功能，A3s又能使DNA發(fā)生突變，通過觸發(fā)DNA突變，APOBEC3基因可能在腫瘤的發(fā)生中具有重要作用?；蚪M測(cè)序技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，由APOBEC3基因所介導(dǎo)的特異性基因突變C>T在多種腫瘤中廣泛存在[9]，NIK-ZAINAL等[10]對(duì)21個(gè)原發(fā)性乳腺癌組織的完整基因組進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)到多個(gè)與APOBEC3基因密切相關(guān)的高突變區(qū)，稱為kataegis。基因突變對(duì)包括乳腺癌在內(nèi)所有遺傳性腫瘤的病因?qū)W機(jī)制是可以確定的[11]，然而SNP位點(diǎn)對(duì)于乳腺癌遺傳度的貢獻(xiàn)仍然有限，最近的研究表明，CNV在基因組中經(jīng)常出現(xiàn)， CNV可以解釋一些復(fù)雜疾病的部分遺傳度水平[12]。從不同基因突變類型所引起的遺傳效應(yīng)的差異角度解釋，CNV較SNP位點(diǎn)對(duì)于基因組序列的影響更大。

本研究選取APOBEC3A基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)(rs5757402，rs17370615和rs12157810)和位于APOBEC3A和APOBEC3B之間的一段缺失變異位點(diǎn)，通過檢測(cè)和分析，結(jié)果顯示，3個(gè)SNP位點(diǎn)中rs17370615位點(diǎn)的等位基因頻率、GA基因型頻率和顯性模型下，在乳腺癌組和對(duì)照組之間具有明顯差異，OR值分別為1.457、1.597和1.627。CNV位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型分布在兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),攜帶Del/Del和Ins/Del基因型的個(gè)體患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶Ins/Ins基因型的個(gè)體的1.629倍和2.927倍；兩組間單倍型比較結(jié)果顯示，CGC和CAA在兩組間比較具有顯著性差異，對(duì)乳腺癌患病OR值分別為0.346和4.587。以上結(jié)果表明APOBEC3基因多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有一定關(guān)聯(lián)性，特別是rs17370615和缺失型CNV位點(diǎn)，可以認(rèn)為攜帶GA、Ins/Del和Del/Del基因型及單倍型CAA是患乳腺癌的危險(xiǎn)因素，而單倍型CGC可以認(rèn)為是保護(hù)因素。本研究中的缺失型CNV位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果與LONG等[13]對(duì)中國(guó)上海人群的分析結(jié)果相同，攜帶缺失型基因Del的個(gè)體較攜帶Ins個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，而歐美白人[14]、摩納哥黑人[15]和中亞伊朗人[16]群體的檢測(cè)結(jié)果也同樣支持以上論斷；而對(duì)于3個(gè)SNP位點(diǎn)的選取和檢測(cè)結(jié)果，摩納哥黑人群體中rs17370615位點(diǎn)的多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病具有相關(guān)性。

本研究將基因多態(tài)性與乳腺癌組的臨床生物學(xué)特性進(jìn)行比較， rs17370615位點(diǎn)乳腺癌組與腫瘤分期存在關(guān)聯(lián)，提示存在于APOBEC3A啟動(dòng)子區(qū)域的SNP位點(diǎn)可能與腫瘤的分化程度相關(guān)，而其余位點(diǎn)均與臨床數(shù)據(jù)無(wú)關(guān)聯(lián)，無(wú)論是從A3s家族蛋白的抑制病毒反轉(zhuǎn)錄和內(nèi)轉(zhuǎn)座子角度，還是從脫氨酶介導(dǎo)的高突變致瘤機(jī)制方面來(lái)闡明，APOBEC3基因的變異或缺失特別是APOBEC3B基因的整碼缺失，與諸多腫瘤的發(fā)生存在一定關(guān)聯(lián)性[17-18]。

綜上所述，本研究通過對(duì)黑龍江漢族女性乳腺癌和對(duì)照組的APOBEC3基因多態(tài)性的檢測(cè)和分析，rs17370615和CNV位點(diǎn)的多態(tài)性與乳腺癌易感性存在關(guān)聯(lián)性，GA、Ins/Del和Del/Del基因型是乳腺癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素；除rs17370615位點(diǎn)與腫瘤分期存在關(guān)聯(lián)以外，APOBEC3基因多態(tài)性與乳腺癌臨床生物學(xué)特性無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，尚不能認(rèn)為缺失型等位基因作為單一因素影響乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程。本研究所取得的階段性數(shù)據(jù)可以為本地區(qū)群體的乳腺癌易感基因的篩選、發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供前期研究數(shù)據(jù)，為乳腺癌的個(gè)體化防治和診斷做出貢獻(xiàn)。