劉洪梅，王希柱，劉 靜，邱 斌,韓素桂，陳艷梅

(河北省唐山市人民醫(yī)院：1.核醫(yī)學(xué)檢驗科;2.心內(nèi)科;3.體檢中心;4.胸外科 063000)

晚期非小細胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer,NSCLC)患者無法行根治性手術(shù)，可選擇鉑類為基礎(chǔ)的兩藥聯(lián)合治療手段。以鉑類為基礎(chǔ)的化療藥能夠控制癥狀，改善生活質(zhì)量，是現(xiàn)在晚期NSCLC標準的治療方案，臨床治療時產(chǎn)生的不良反應(yīng)及部分患者對化療的耐受性差等問題限制了鉑類足量使用。近年醫(yī)學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)1,25-二羥基維生素D3[1,25(OH)2D3]參與調(diào)節(jié)機體免疫功能，減少多種炎性因子表達，發(fā)揮多種生物學(xué)功能[1-2]，還可通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)細胞分化、促進細胞凋亡等方式來發(fā)揮抗腫瘤作用[3-4]。本實驗通過觀察鉑類藥物與1,25(OH)2D3聯(lián)合作用對原代肺癌細胞的殺傷作用，探討1,25(OH)2D3對鉑類抗癌藥物的增敏作用，為肺癌的綜合治療提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 選取2017年1-5月本院胸外科收治的伴有惡性胸腔積液患者5例，經(jīng)病理學(xué)或細胞學(xué)證實為NSCLC，其中腺癌4例，鱗癌1例。試劑：1,25(OH)2D3購自美國Sigma公司，溶于無水乙醇并配成儲備液，-20 ℃儲存?zhèn)溆?；CCK-8購自同仁化學(xué)研究所；細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；順鉑(DDP)注射液、卡鉑(CBP)注射液、奈達鉑(NDP)購自山東齊魯制藥有限公司。

1.2方法

1.2.1原代肺癌細胞培養(yǎng) 無菌常規(guī)胸腔穿刺留取胸腔積液，1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌2次，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，按細胞懸液∶Ficoll液體積比2∶1，將細胞懸液緩慢貼壁加入含F(xiàn)icoll液的離心管中，水平離心機2 000 r/min離心15 min，離心后吸取Ficoll液面上方乳白色液體，加入無菌離心管中，加適量PBS洗滌2次，每次1 000 r/min離心5 min。將洗滌后的細胞用含10%血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，棄去上清液，加入含10%血清RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)待細胞貼壁80%時，傳代用于后續(xù)實驗。

1.2.2CCK-8法檢測細胞抑制率 取對數(shù)生長期的肺癌細胞，臺盼藍染色活細胞計數(shù)調(diào)整細胞濃度2×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)液200 μL。單純肺癌細胞培養(yǎng)作為對照組；實驗藥物組分為7組：DDP組，濃度分別為1、2、4、8和16 μg/mL；CBP組，濃度分別為5、10、25、50和100 μg/mL；NDP組，濃度分別為1、2、4、8和16 μg/mL；1,25(OH)2D3組，濃度分別為10、20、40、160和320 ng/mL；聯(lián)合藥物組，為DDP(4 μg/mL)+1,25(OH)2D3(20 ng/mL)、CBP(50 μg/mL)+1,25(OH)2D3(20 ng/mL)、NDP(6 μg/mL)+1,25(OH)2D3(20 ng/mL)。每組均設(shè)5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)至加藥后24、48、72 h每孔加入20 μL的CCK-8，繼續(xù)孵育2 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo公司)450 nm檢測各孔吸光度(OD)值，按以下公式計算：細胞增殖抑制率=(對照組OD-實驗組OD)/對照組OD×100%，以濃度的對數(shù)與抑制率進行直線相關(guān)分析。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞周期的變化 取對數(shù)生長期細胞，以1×105個/mL接種于直徑60 mm的培養(yǎng)皿中，24 h貼壁后棄去培養(yǎng)液，按實驗分組加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)液。加藥作用24 h后收集細胞，按照細胞周期檢測試劑盒(凱基生物)使用說明進行操作，PBS離心洗滌后加入預(yù)冷的70%乙醇4 ℃固定過夜。然后PBS離心洗滌并收集細胞，重懸于PBS，加入100 μL RNase-A于37 ℃水浴消化30 min后加入400 μL 碘化丙啶(PI)混勻，室溫避光染色30 min后流式細胞儀(美國BD公司)檢測并分析細胞周期，計算細胞增殖指數(shù)。增殖指數(shù)=(S期百分比+G2/M期百分比)/(G0/G1期百分比)。

1.2.4Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力 取對數(shù)生長期細胞，用無血清的培養(yǎng)基制成單細胞懸液，使細胞濃度為1×105個/mL。加200 μL細胞懸液至鋪好Matrigel膠的Transwell小室中，將Transwell小室放入24孔板中，下室加入含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液600 μL，每組設(shè)置2個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去小室微孔膜上層細胞后PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛室溫下固定20 min后PBS沖洗2遍，1%結(jié)晶紫染色30 min，蒸餾水沖洗。倒置顯微鏡下對穿至微孔膜下層的細胞計數(shù)。每份標本選取5個視野計數(shù)細胞個數(shù)，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1藥物對肺癌細胞增殖抑制率的影響 各組單藥作用肺癌細胞，隨著給藥濃度的增加，時間的延長，對細胞的生長抑制作用也逐漸增加，呈現(xiàn)明顯的時間劑量依賴效應(yīng)。選擇每個鉑類藥物最接近半數(shù)抑制濃度的藥物劑量(IC50)分別與低劑量(20 ng/mL)1,25(OH)2D3聯(lián)合作用于細胞，對腫瘤細胞的增殖抑制作用增強，與對應(yīng)的鉑類單藥比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2藥物對肺癌細胞周期的影響 與對照組比較，DDP組、CBP組、NDP組和1,25(OH)2D3組的G0/G1期的細胞比例都有增加；DDP組、CBP組、NDP組S期細胞比例降低；CBP組、NDP組G2/M期細胞比例增加。與對應(yīng)的鉑類單藥組比較，DDP+1,25(OH)2D3聯(lián)合組的G0/G1期的細胞比例升高,G2/M的細胞比例明顯降低(均P<0.05)；CBP+1,25(OH)2D3聯(lián)合組的G0/G1期的細胞比例升高,S期的細胞比例有所增加，G2/M的細胞比例明顯降低(均P<0.05)；NDP+1,25(OH)2D3聯(lián)合組的G0/G1期的細胞比例升高(P<0.05),S期的細胞比例明顯降低(P<0.05)，G2/M的細胞比例變化不明顯(P>0.05)，見表2。

表1 各組藥物對肺癌細胞增殖的影響

a：P<0.05，與4 μg/mL DDP比較;b：P<0.05，與50 μg/mL CBP比較;c：P<0.05，與4 μg/mL NDP比較

表2 各組藥物對肺癌細胞周期的影響

續(xù)表2 各組藥物對肺癌細胞周期的影響

a:P<0.05，與對應(yīng)的鉑類藥物組比較

2.3藥物對肺癌細胞的侵襲影響 Transwell實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對應(yīng)的鉑類單藥組比較,肺癌細胞經(jīng)DDP、CBP、NDP與1,25(OH)2D3聯(lián)合作用處理24 h后，腫瘤細胞的侵襲能力呈現(xiàn)不同程度的下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

A:對照組；B:DDP組；C:CBP組；D:NDP組；E:1,25(OH)2D3組；F:DDP+1，25(OH)2D3組；G:CBP+1,25(OH)2D3組；H：NDP+1,25(OH)2D3組；a:P<0.05，與對應(yīng)鉑類單藥組比較

3 討 論

原發(fā)性肺癌是我國主要惡性腫瘤之一,大多數(shù)肺癌患者被發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)屬于中晚期，不能接受手術(shù)治療，采用化療的方式是目前治療NSCLC患者的主要治療方式。鉑類化療藥物聯(lián)合第3代化療藥物的雙藥化療方案可進一步提高臨床療效，其總緩解率可達50%，中位生存時間達14.2個月，1年生存率提高到54%。DDP作為臨床常用的化療藥物之一，主要通過調(diào)控腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡達到抗腫瘤效果[5-6]，但其存在消化道反應(yīng)、腎毒性、骨髓抑制等不良反應(yīng)[7-8]。其療效與劑量呈正比，不良反應(yīng)也與劑量相關(guān)，故臨床工作中常因不良反應(yīng)而限制其用量。維生素D為固醇類衍生物,吸收的維生素D運到肝臟中，在微粒體中經(jīng)單氧酶系統(tǒng)作用，將其25位羥基化形成[1α,25(OH)D3]，[1α,25(OH)D3]在腎線粒體單氧酶作用下經(jīng)羧基化，轉(zhuǎn)變?yōu)?,25(OH)2D3，其為維生素D的主要生物作用形式。近年來一些體內(nèi)外的實驗研究證實，維生素D具有抑制腫瘤增殖、促進凋亡、抑制分化的作用，POURGHOLAMI等[9]在小鼠體外實驗中，發(fā)現(xiàn)Hep-3B、PLC/PRF/5、SKHEP-1細胞的增殖被1,25(OH)2D3明顯抑制，體內(nèi)實驗中不同劑量1,25(OH)2D3能夠顯著抑制裸鼠的SKHEP-1腫瘤生長。CAPUTO等[10]通過實驗證實，1,25(OH)2D3對人肝癌細胞系HepG2的抑制作用是發(fā)生在細胞周期的G0/G1期，G0/G1細胞比例隨1,25(OH)2D3濃度的增加而增加，并伴有S期細胞數(shù)量的減少。余曉燕等[11]通過檢測患者血清中25羥維生素D[25(OH)D]和維生素D結(jié)合蛋白的濃度，分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，血清中維生素D和維生素D結(jié)合蛋白濃度高低在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要意義，兩者可作為NSCLC患者預(yù)后評估的輔助指標。 SABZICHI等[12]用載有維生素D的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)體(NLC)與多柔比星(Dox)同時給藥乳腺癌細胞MCF-7,結(jié)果細胞增殖百分比從(49.0±7.2)%降低至(37.0±5.1)%，細胞凋亡百分比增加兩倍(P<0.05)。 在本實驗中，結(jié)果顯示DDP、CBP、NDP和1,25(OH)2D3單獨使用對惡性胸腔積液中分離的肺癌細胞生長具有抑制作用，各鉑類藥物與1,25(OH)2D3聯(lián)合應(yīng)用時，抑制率明顯高于鉑類單藥，并且具有時間濃度依賴性的特點。通過流式細胞儀檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)，3個鉑類藥物和1,25(OH)2D3聯(lián)合作用時G0/G1期細胞比例增加，抑制細胞進入DNA合成期和有絲分裂期，兩者聯(lián)合應(yīng)用能夠抑制細胞增殖。Transwell實驗結(jié)果顯示，聯(lián)合處理后，發(fā)生侵襲的肺癌細胞數(shù)量顯著減少。

綜上所述，本實驗通過選擇NSCLC晚期患者的胸腔積液中原代細胞作為實驗?zāi)[瘤細胞，結(jié)果表明DDP、CBP、NDP聯(lián)合1,25(OH)2D3作用可抑制肺癌細胞的增殖、侵襲能力，誘導(dǎo)細胞凋亡，1,25(OH)2D3能夠增強鉑類藥物的化療敏感度，減少單獨大劑量使用鉑類藥物的不良反應(yīng)，為肺癌的綜合治療提供更多依據(jù)。