朱 波，張梅梅，祖新政，趙俊亮*，王登峰

（1.新疆呼圖壁種牛場有限公司，新疆 呼圖壁縣 831100；2.新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所（新疆畜牧科學院動物臨床醫(yī)學研究中心），烏魯木齊 830000）

產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)，舊稱魏氏梭菌，是一種廣泛分布于水源、土壤等自然界以及動物腸道中的條件致病性細菌，該菌環(huán)境耐受性強、致病因子多種多樣，常導致人和多種家畜發(fā)生不同臨床癥狀的疾病，如：人氣性壞疽、食物中毒，牛羊猝死綜合癥、羊腸毒血癥、牛腸道出血綜合癥、羔羊痢疾、仔豬紅痢、禽壞死性腸炎等[1]。由于產氣莢膜梭菌的導致的疾病發(fā)病急、病程短、病死率高，它的流行常給家畜養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經濟損失[2]。自20世紀80年代以來，國內一些研究單位成功研制了產氣莢膜梭菌多價滅活疫苗，為該病的有效防治做出了重要貢獻。但近年來，即使在一些免疫畜群，仍然出現產氣莢膜梭菌的感染，如何有效防控該病成為當前家畜養(yǎng)殖業(yè)可否健康發(fā)展的障礙之一。有鑒于此，本文綜述了產氣莢膜梭菌診斷和檢測方法，并從疫苗預防和抗生素治療等方面進行防治技術方面總結，為基層臨床獸醫(yī)提供該病的預防和治療參考資料。

1 實驗室診斷

敗血癥型產氣莢膜梭菌感染的診斷相對簡單，根據死亡動物的臨床癥狀、剖檢病理變化（主要表現為敗血癥的臨床癥狀和剖檢病理變化）和顯微鏡檢查、直接涂片的革蘭氏染色和細菌培養(yǎng)可以做初步診斷，其中，產氣莢膜梭菌在動物死亡后獲得的病變或病理組織中被檢出，可以確定其可能是致病因素；但大腸桿菌等其他細菌也可以引起動物敗血癥死亡，動物死亡后，產氣莢膜梭菌可快速侵入，此時檢出該菌就不能確定其為致病菌，需要進行血清中和試驗進行確診。

1.1 病原學診斷

細菌的分離培養(yǎng)和鑒定是進行細菌性傳染病確診的常用診斷方法。根據感染疾病臨床特征、革蘭氏染色特性、細菌形態(tài)和生化特性可以對該類細菌的感染做出初步診斷[3]。產氣莢膜梭菌常規(guī)生化鑒定通常采用糖發(fā)酵試驗、七葉苷水解試驗、產吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠水解試驗、乳蛋白水解試驗中的“暴烈”發(fā)酵反應等[4]。此外，基于氣相-液相色譜對代謝產物短鏈脂肪酸的分析同樣用于產氣莢膜梭菌的鑒定，揮發(fā)性脂肪酸色譜分析顯示，產氣莢膜梭菌產乙酸、丙酸、丁酸[5]，部分菌株也可產琥珀酸和乳酸[6]，但該方法尚不能進行亞型（如毒素型）區(qū)分，且費時費力、檢測成本高等難以廣泛應用于臨床檢測。

隨著微生物及傳染病研究的深入，對微生物進行型、亞型、株乃至分子水平上的鑒定顯得極為重要。分子生物學理論和技術在傳染病檢測與診斷中的廣泛應用，使得細菌鑒定更加準確、快捷和經濟節(jié)約。當前，用于產氣莢膜梭病診斷的技術主要有聚合酶鏈式反應（PCR）技術、16S rRNA序列測定和同源分析技術、核酸探針技術等。

1.1.1 PCR技術

依據產氣莢膜梭菌α毒素、β毒素、ε毒素和ι毒素的型特異基因發(fā)展而來的多重PCR方法廣泛應用于產氣莢膜梭菌毒素型的鑒定[7,8]。同時，還可以根據生產和研究需要，設計特異PCR引物用于特定來源菌株的鑒定，如對糞便樣本中腸毒性產氣莢膜梭菌的鑒定等[9]。由于該方法具有快捷、簡便、易操作等優(yōu)點，已取代血清中和試驗用于產氣莢膜梭菌的毒素分型。

1.1.2 16S rRNA序列測定和同源分析技術

16S rRNA是病原菌檢測和鑒定的一種強有力工具，可以實現對病原菌進行快速、微量、準確地分類鑒定。根據GenBank公布的產氣莢膜梭菌16S rRNA序列分析發(fā)現，產氣莢膜梭菌種間16S rRNA同源性達到了99.8%以上，表現高度保守，目前多對國際通用細菌16S rRNA PCR擴增引物可供選擇，測序通過獲得16S rRNA序列可以快速準確地進行種的鑒定[10]。Smith等人利用該方法擴增16S rRNA片段、測序并在NCBI網站BLAST搜索后，與已知產氣莢膜梭菌16S rRNA序列相似性為100%，確定為產氣莢膜梭菌[11]。與傳統(tǒng)生化鑒定方法，該方法較為快捷、準確地給出試驗結果，減少了試驗環(huán)節(jié)操作不當或失誤造成的結果誤判。

1.1.3 核酸探針技術

Van Damme-Jongsten[12]等人報道了用32P標記探針檢測食物中毒樣品中的腸毒性產氣莢膜梭菌的研究；我國杜薔等人[13]建立了基于地高辛標記的腸毒素特異性基因原位雜交檢測方法，該方法不僅具有較高的敏感性和特異性，同時還克服了32P標記探針的放射污染的問題。

1.1.4 SDS-PAGE技術

SDS-PAGE技術是利用聚丙烯酰胺凝膠的分子篩效應，根據不同毒素型菌株所產生的主要毒素蛋白相對分子質量、形狀及其所帶電荷量的差異實現對其梯度分開，進而根據菌株含有的主要毒素進行毒素分型。于曉霞等[14]建立了SDS-PAGE毒素分型方法，并開展了臨床分離株的分型調查，其檢測結果與多重PCR檢測結果具有較高的一致性。雖然該方法較為簡單快捷，但由于不同菌株分泌毒素能力存在一定差異，菌液上清毒素處理是確保檢測結果可靠性的關鍵，因此還有待更多試驗數據予以驗證。

1.1.5 基因芯片技術

基因芯片又稱DNA微陣列(DNA microarray)，是采用原位合成或直接點樣的方法將DNA片段或寡核苷酸片段排列在基片表面形成微矩陣，待檢樣品用同位素或熒光分子標記后，與微矩陣上探針通過DNA-DNA堿基配對雜交，經過掃描及計算機分析即可獲得樣品中大量的基因序列及表達信息，達到敏感、高通量、特異性地分析生物信息的目的[15]。趙渝徽[16]利用該技術成功構建了壓電石英晶體傳感器產氣莢膜梭菌基因芯片檢測系統(tǒng)，能夠有效檢測產氣莢膜梭菌的毒素基因并能分型鑒定三種產氣莢膜梭菌毒素。

1.2 血清學診斷

產氣莢膜梭菌感染的血清型診斷主要有血清中和試驗、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，它們可應用于感染菌株的血清型鑒定或所產毒素的定型，也可用于感染菌株的血清抗體水平檢測。

1.2.1 血清中和試驗

血清中和試驗是評價產氣莢膜梭菌毒素效價和毒素分型的經典方法，廣泛用于疫苗效果評價和菌株分型鑒定。該方法把產氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清毒素、培養(yǎng)上清毒素與抗血清中和后混合物接種小鼠或豚鼠，通過觀察小鼠是否被保護，豚鼠皮膚是否發(fā)生壞死等臨床指標進行判定。由于體外培養(yǎng)的ε毒素、ι毒素以原毒素形式存在于上清中，需經胰蛋白酶等酶激活后才具有毒素活性；并且，毒素分型試驗中需要多次中和試驗才能判定結果，導致該方法費時費力且耗費較高，并不利于臨床實際操作[17,18]。當前，廣泛建立的ELISA和PCR方法可解決上述不足。

1.2.2 酶聯免疫吸附試驗

ELISA診斷方法具有快速、簡便、特異、敏感和高通量的檢測特點，澳大利亞Uzal等人[19]建立了間接 ELISA（Indirect ELISA）和競爭 ELISA（competitive ELISA）方法用于評價 ε毒素抗血清效價，兩種ELISA方法與小鼠血清中和試驗關聯系數分別為0.99、0.98，結果基本一致。McCourt等人[20]報告了夾心EILSA（Sandwich ELISA）用于產氣莢膜梭菌壞死性腸炎的診斷，診斷結果也與商品化夾心ELISA診斷試劑盒檢測結果相同。國內也有研究人員報道用間接ELISA和斑點ELISA（dot-ELISA）進行腸毒血癥診斷的研究[21,22]，也取得了較好結果。但由于產氣莢膜梭菌不同血清型菌株所產毒素種類復雜多樣，使得產氣莢膜梭菌病的ELISA診斷與檢測在我國尚處在試驗研究階段。

2 防 治

產氣莢膜梭菌是腸道菌群的一部分，外界環(huán)境的突然變化或其它應激破壞動物腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，從而導致梭菌的快速、大量繁殖，釋放的毒素導致疾病的暴發(fā)。該病發(fā)病急、病程短且死率高，故防治中以免疫預防為主；同時，減少抗生素的使用和應激防止動物腸道菌群的失衡在預防該病中也有積極作用。此外，維持腸道穩(wěn)態(tài)、克服外界刺激的益生菌等微生態(tài)制劑可能有一定的預防作用。發(fā)病后，及時發(fā)現并在發(fā)病早期使用抗生素治療可能會降低損失。

2.1 免疫預防

目前，滅活疫苗是預防產氣莢膜梭菌性疾病的主要有效方法。制苗菌株一般選擇一定區(qū)域內優(yōu)勢毒素型菌株，通過發(fā)酵生產外泌毒素，經甲醛等方法滅活后加佐劑制備成類毒素疫苗。國內常見的疫苗有以腐敗梭菌和產氣莢膜梭菌C型（或B型）、D型菌種制備的預防羊快疫、羊猝狙、腸毒血癥和羔羊痢疾的三聯四防疫苗和經工藝改良的三聯四防疫濃縮苗。這類疫苗已經商業(yè)化生產并廣泛應用綿羊梭菌病的防治。除此之外，我國王克領、薛家賓等人分別研制出了兔出血癥-魏氏梭菌病-巴氏桿菌病三聯苗[23,24]；趙立峰用本地分離的鹿源產氣莢膜梭菌研制出鹿出血性腸炎疫苗[25]。

在國外，家畜產氣莢膜梭菌病免疫也是牛羊免疫程序中的重要組成部分，如用于預防牛羊腸毒血癥和梭菌性腸炎的UltrabacRCD疫苗，為產氣莢膜梭菌C型和D型菌苗-類毒素疫苗；用于家畜多種梭菌病免疫預防的Ultrabac8疫苗，為肖韋梭菌-腐敗梭菌-溶血梭菌-諾維梭菌-污泥梭菌-C型和D型產氣莢膜梭菌疫苗，和Ultrabac7/Somubac疫苗，為肖韋梭菌-腐敗梭菌-諾維梭菌-污泥梭菌-C型和D型產氣莢膜梭菌疫苗；Scourguard4KC為牛輪狀病毒-冠狀病毒滅活苗-C型產氣莢膜梭菌-大腸桿菌菌苗-類毒素疫苗，用于預防健康和妊娠牛群腹瀉??；C型產氣莢膜梭菌-大腸桿菌菌苗-類毒素疫苗（Scourmune-C）用于預防豬的大腸桿菌病和梭菌性腸毒血癥。

2.2 抗生素的治療

雖然產氣莢膜梭菌所引起的疫病發(fā)病急，死亡快，但在發(fā)病初期（尚未大量產生毒素階段），采用敏感抗生素進行治療，仍可取得一定的治療效果。根據產氣莢膜梭菌的耐藥基因檢測、序列分析和臨床的應用，臨床分離株普遍對青霉素G、頭孢菌素、四環(huán)素、氯霉素、鹽霉素、莫能菌素、呋喃唑酮、利福平、桿菌肽、卡巴多、紅霉素、林可霉素、克林霉素、氨丙啉、雙呋脒腙和維吉尼亞霉素敏感，但對黃霉素和氨基糖苷類抗生素有抵抗力[26,28]。但也有報道稱從豬和家禽分離的一些菌株對四環(huán)素、桿菌肽、維吉尼亞霉素、大環(huán)內酯-林可酰胺類（macrolide-lincosamide）抗生素和其他用于促進生長和預防疾病的抗菌劑具有獲得性耐藥性[28]，并有一項研究報道稱來自家畜的大多數菌株對鏈霉素、紅霉素、頭孢菌素、林可霉素、四環(huán)素、桿菌肽和羧芐青霉素有抵抗力，甚至有超過15%的分離株對青霉素有抵抗力[28]。因此，根據當地流行菌株耐藥狀況，選擇敏感類抗生素進行該病的早期治療，可能會降低產氣莢膜梭菌病造成的損失。

此外，維護動物腸道菌群的穩(wěn)態(tài)可減少梭菌病的發(fā)生。益生菌在維持腸道穩(wěn)態(tài)、克服外界刺激、抵御產氣莢膜梭菌病感染中可發(fā)揮重要作用[27]。Teo等人[29]等從健康雞胃腸道篩選到一株新型枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），該菌可分泌一種抗梭菌因子，能夠有效抑制產氣莢膜梭菌在內的多種細菌的生長繁殖。該項研究也為產氣莢膜梭菌的生物防治提供了可能。

3 結 語

產氣莢膜梭菌的感染是近年來家畜養(yǎng)殖業(yè)中的流行較廣、死亡率較高的疫病之一。雖然傳統(tǒng)的類毒素疫苗在防治中發(fā)揮著重要作用，但由于長期高密度的免疫，由疫苗毒株所覆蓋的產氣莢膜梭菌毒素得到了較好的控制，近年來，由于毒力因子的水平轉移及其新毒素的發(fā)現，使得該菌引起或繼發(fā)的感染有所加重。此外，產氣莢膜梭菌作為一種條件性致病菌，飼養(yǎng)方式、飼草料結構以及氣候條件的突然改變，都提高了產氣莢膜梭菌病流行的風險。在當前形勢下，傳統(tǒng)疫苗廣泛代表性菌株的篩選、新型高效疫苗的研制以及抗產氣莢膜梭菌新型靶標藥物的開發(fā)仍是未來防治該病的重要措施之一。在采用疫苗、藥物進行防治的同時，細化日常管理、保持良好的飼養(yǎng)環(huán)境、維持飼草料結構的平衡也是有效防控該病的主要措施。只有通過營養(yǎng)、日常管理、合理藥物使用與高效疫苗的研發(fā)等綜合措施，才能有效預防產氣莢膜梭菌的感染、降低該病的發(fā)病率，從而有利于家畜養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。