趙孔祥，高健會，宓捷波，劉旸，葛寶坤，鄭文杰

（1.天津海關動植物與食品檢測中心，天津300461；2.天津師范大學生命科學學院，天津300387）

隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展，人們對葡萄酒的認識不斷提升，葡萄酒在國內無論是產(chǎn)量還是消費量增長十分迅速，中國已經(jīng)成為全球第五大葡萄酒消費國。為了獲得高額利潤，部分不法商家進行了產(chǎn)地造假、原材料造假、品牌造假等，這些行為嚴重危害了消費者的權益。葡萄酒真?zhèn)蔚蔫b別越來越受到重視，針對葡萄酒的制假問題，歐盟開發(fā)了葡萄酒數(shù)據(jù)庫銀行，用于對葡萄酒的真實屬性進行鑒定[1]，但我國在葡萄酒鑒定方面的研究還非常薄弱。

葡萄酒消費者習慣于根據(jù)葡萄酒標簽來判定葡萄酒的優(yōu)劣，其中葡萄酒產(chǎn)地和產(chǎn)區(qū)最受關注，但目前還沒有有效方法能對葡萄酒產(chǎn)地進行鑒別與溯源。國際上葡萄酒產(chǎn)地溯源的方法越來越多，例如無機元素指紋法[2-3]、香氣指紋法[4-5]，以及穩(wěn)定同位素比值法[5-10]等，其中穩(wěn)定同位素比值能很好地指示地域和氣候特性，目前已經(jīng)成為產(chǎn)地溯源的重要方法[8，11]。目前，已有液相色譜-穩(wěn)定同位素質譜測定葡萄酒中的乙醇（ethanol）、丙三醇（glycerol）的方法，但由于液相色譜法必須用水作為流動相，能分析的物質有限，目前僅能分析乙醇和丙三醇[9]。氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比率質譜法對所分析物質限制較少，可以分析葡萄酒中更多的風味物質，并且由于前處理簡便，可以保證測定速度和準確性[10]。不同產(chǎn)地葡萄酒可能由于葡萄品種和釀造方式的差異導致風味物質穩(wěn)定同位素組成的變化，因此風味物質的穩(wěn)定同位素比值可作為產(chǎn)地溯源的指標[12]。本研究采用氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質譜儀（gas chromatography combustion isotope ratio mass spectrometer，GC-C-IRMS），建立了葡萄酒中乙醇、丙三醇、2，3-丁二醇（2，3-butanediol）、乳酸乙酯（ethyl lactate）、異戊醇（3-methyl butanol）、乙酸（acetic acid）6種風味物質碳穩(wěn)定同位素比值的測定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

DELTA V Advantage同位素質譜儀（配備Trace 1310氣相色譜儀與GCIsolink接口）、ISQ質譜儀（配備Trace GC氣相色譜儀）：美國Thermo Fisher公司；MILLI-Q純水器：美國Millipore公司。

1.1.2 試劑

He（99.999%）、CO2參考氣：北京氦普分氣體有限公司；乙醇同位素標準物質（BCR-656，歐洲標準物質中心，啄13CVPDB=-26.91‰±0.07‰），甘油（標準品，純度≥99.9%）、3-甲基丁醇（標準品，99.9%）、丙三醇（標準品，99.9%）：德國 Dr Ehrenstorfer；乳酸乙酯（標準品，≥99.9%）、乙酸（標準品，99.9%）：上海安譜實驗科技有限公司。

1.2 樣品前處理方法優(yōu)化

所有標準品均用水配制為適當濃度，溶液峰高以與樣品中該物質峰高接近為宜。取2 mL樣品，過0.45 μm水系濾膜，進樣分析，如果峰高過大，需調整進樣口分流比至適當后再做分析。

1.3 色譜條件優(yōu)化

優(yōu)化不同組分測試的氣相色譜升溫程序，使各組分得到良好的分離；優(yōu)化進樣量及進樣口分流比，使樣品中待測物質信號與參考氣信號相當。

1.4 葡萄酒中2，3-丁二醇的確認

將葡萄酒樣品注入氣相色譜-質譜儀，全掃描方式采集（質量數(shù)設定為20 m/z～200 m/z），對特征峰進行NIST譜庫檢索。

1.5 精度和準確性試驗

根據(jù)樣品中風味物質含量配制水平相當?shù)臉藴势啡芤海掖紳舛扰錇?%，甘油濃度配為5 mg/mL，異戊醇、乳酸乙酯、乙酸配制為1.0 mg/mL，分別測定10次，計算測定結果的標準偏差（standard deviation，SD）。

1.6 穩(wěn)定性試驗

隨機選取某葡萄酒樣品進行7次重復測定，計算其SD值。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

葡萄酒中各風味物質含量差別較大，乙醇是糖的發(fā)酵產(chǎn)物，含量通常為7%～16%，甘油是酒精發(fā)酵的主要副產(chǎn)物，其含量通常為5 g/L～12 g/L。葡萄酒的主要風味物質包括醇類、酯類和有機酸等，其中異戊醇（3-甲基丁醇）、2，3-二丁醇、乳酸乙酯、乙酸幾種風味物質含量較高，一般為幾十至幾百毫克每升[13]。

由于葡萄酒中乙醇含量太高，樣品需要進行稀釋，當樣品稀釋5倍時，通過結合減少進樣量至0.1 μL和增加分流比至50∶1，樣品信號基本上在10 000 mV左右，同位素比值較穩(wěn)定。其他項目可以通過調整分流比及進樣量獲得合適的信號值，因此樣品可以直接測定。

2.2 氣相色譜條件優(yōu)化

色譜柱：由于乙醇、乙酸、甘油等風味物質均為極性化合物，選擇WAX柱分離效果最好，因此最終選擇DB-wax氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。

由于乙醇含量較高，應盡可能減少進樣量，同時要增大分流比，最終優(yōu)化后乙醇測定色譜條件為：進樣量0.1 μL，進樣口溫度250℃，載氣為高純He，流速1.5 mL/min，分流比50∶1。程序升溫條件：初溫40℃，保留1 min，50℃/min升溫至220℃，保留3 min。

其他組分僅通過增加分流比即可得到最佳的信號強度。優(yōu)化后色譜條件如下。

甘油分析：進樣量0.5 μL，進樣口溫度270℃，載氣為高純He，流速1.5mL/min，分流比10∶1。程序升溫條件：初溫80℃，保留1 min，15℃/min升溫至240℃，保留2 min。

其它風味組分：進樣量0.5 μL，進樣口溫度250℃，載氣高純He，流速1.5 mL/min，分流比5∶1。程序升溫條件：初溫80℃，保留1 min，15℃/min升溫至240℃，保留2 min。

優(yōu)化后標準品溶液及樣品同位素質譜圖見圖1和圖2。

2.3 葡萄酒中2，3-丁二醇的確認

葡萄酒樣品分析中發(fā)現(xiàn)乙酸出峰后面有一與其峰高接近的峰，其碳同位素比值也與乙酸及其他組分接近，該峰可能也是一種風味物質。為確認該未知峰，采用氣相色譜-質譜（gas chromatography mass spectrometer，GC-MS）全掃描進行樣品分析，色譜條件與與GC-C-IRMS條件相同，葡萄酒樣品全掃描總離子流圖見圖3。

對主要色譜峰進行NIST譜庫檢索，確認峰1為異戊醇，峰2為乳酸乙酯，峰3為乙酸，與同位素質譜色譜峰結果相吻合。峰4對應同位素質譜圖中383 s的色譜峰，對其質譜圖進行檢索結果見圖4。

該色譜峰與NIST譜庫主庫（mainlib）中2，3-二丁醇質譜圖吻合度最高。根據(jù)文獻報道，葡萄酒中一般均含2，3-二丁醇這一風味物質[13]，因此基本可確認該同位素峰為2，3-二丁醇。

圖1 標準品溶液同位素質譜圖Fig.1 Chromatography of standard solution about five flavours

圖2 葡萄酒樣品風味物質同位素質譜圖Fig.2 Chromatography of wine about five flavours

2.4 精度和準確性

2%乙醇溶液，5 mg/mL甘油溶液，1.0 mg/mL的異戊醇（3-甲基丁醇）、乳酸乙酯、乙酸混合溶液，分別測定10次，計算測定結果的標準偏差（SD），結果如表1所示，均達到國際通行質控標準要求（SD小于0.3‰）[14]。

2.5 穩(wěn)定性

葡萄酒樣品基質復雜，其他部分未知成分可能干擾色譜分離，進而影響測定結果精度，為了驗證方法的穩(wěn)定性，隨機選取1只葡萄酒樣品進行7次重復測定，計算其SD值，結果見表2，各物質SD小于葡萄酒樣品的分析誤差0.6‰[15]。

2.6 實際樣品測定

采用本方法測定3種法國和2種南非的葡萄酒中

圖3 葡萄酒樣品全掃描總離子流圖Fig.3 Chromatography of total ion current of wine in fullscan model

圖4 葡萄酒樣品未知峰NIST譜庫檢索結果Fig.4 Results of searching in the library of NIST about unkown peak in wine

表1 5種風味物質碳同位素比值Table 1 Carbon isotope ratio of five flavour characters about standard solution

表2 葡萄酒樣品6種風味物質碳同位素比值Table 2 Carbon isotope ratio of six flavour characters about wine

表3 法國和南非部分葡萄酒樣品碳同位素比值Table 3 Carbon isotope ratio of French and South African several wines

通過進一步增加樣品量，結合統(tǒng)計分析，比較不同產(chǎn)地風味物質同位素比值差異，有可能為葡萄酒產(chǎn)地分析提供更加豐富的信息。

3 結論

GC-C-IRMS可以實現(xiàn)葡萄酒中6種風味物質的碳穩(wěn)定同位素比值測定，而常用分析方法僅能分析乙醇、甘油的碳同位素比值，本方法可以分析葡萄酒其他風味物質的差異，以期進一步發(fā)現(xiàn)釀制工藝、產(chǎn)地差異的影響，通過進一步增加樣品量結合統(tǒng)計分析，為葡萄酒溯源分析提供依據(jù)。