姚新鼎，姜飛燕，王玉偉，袁岐山

（1.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程系，河南開(kāi)封475004；2.開(kāi)封市綠色涂層材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南開(kāi)封475004；3.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，河南鄭州450000）

山竹學(xué)名莽吉柿，雙子葉植物，具有極高的藥用價(jià)值。山竹中的成分對(duì)多種病癥效果顯著，如腹痛、腹瀉、感染性創(chuàng)傷、慢性潰瘍等疾病的治療。山竹不但具備抗氧化能力，也有助增進(jìn)免疫系統(tǒng)健康[1]。

總黃酮提取方法有雙水相提取法、大孔樹(shù)脂吸附法、半仿生提取法、超聲提取法、微波輔助提取法等[2]。雙水相提取法分相快，易操作，提取率高，但成本較高[3-4]；大孔樹(shù)脂吸附法選擇性好，吸附速度快，但操作復(fù)雜，工藝要求較高[5-6]；半仿生提取法生產(chǎn)周期短，成本低，但提取效果較差[7-8]；超聲法提取操作簡(jiǎn)單、速度快、消耗小，但總黃酮提取純度較低[9-10]；微波輔助提取法具有操作時(shí)間短、消耗少、效率高、污染小等特點(diǎn)[11-12]。因此本試驗(yàn)利用微波輔助法探討山竹殼中總黃酮的提取工藝，為山竹的進(jìn)一步研究提供條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山竹：廣西省玉林市；氫氧化鈉（分析純）：上海德榜化工有限公司；硝酸鋁（分析純）：廊坊市鵬彩精細(xì)化工有限公司；過(guò)氧化氫（分析純）：德州潤(rùn)昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；硫酸亞鐵（分析純）：北京康普匯維科技有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）：杭州富強(qiáng)化工有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：中國(guó)藥品生物制品鑒定所本試驗(yàn)所；1，1-二基-2-苦基肼自由基（DPPH）（分析純）：蘇州亞科科技股份有限公司。

1.2 樣品預(yù)處理

將山竹殼洗凈、風(fēng)干后切成片狀，放在烘箱中干燥至質(zhì)量恒定，研磨并過(guò)篩，置于棕色瓶備用。

1.3 儀器與設(shè)備

DHG-9070B型電熱鼓風(fēng)干燥箱：山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；FW-400A型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；SECURA 1103-1CEU大量程精密天平：廣州市深華生物有限公司；XO-SM100型超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)：南京先歐儀器制造有限公司；KL05RF低速離心機(jī)：重慶譽(yù)嶺科技有限公司；DL-1209型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：廈門(mén)德量檢測(cè)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 微波輔助提取

參照崔鵬等[13-15]的方法，取適量的樣品，加入乙醇溶解后靜置20 min，在適當(dāng)功率和提取時(shí)間下，制得待測(cè)液。進(jìn)行多次平行試驗(yàn)，取算術(shù)平均值。

1.4.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備與標(biāo)線的繪制

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.020 0 g，用少量30%的乙醇溶解，轉(zhuǎn)移定容至100 mL容量瓶，溶液濃度為0.20 mg/mL。標(biāo)線的繪制：用移液管分別移取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于 10 mL 的比色管中，依次加入適量體積的亞硝酸鈉、亞硝酸鋁、氫氧化鈉溶液，并用30%的乙醇定容，搖勻后靜置20 min。測(cè)定（505 nm）吸光度值。山竹殼中總黃酮質(zhì)量濃度計(jì)算公式如下：

式中：Y為樣品中總黃酮提取率，mg/g；C為山竹殼中總黃酮類化合物的質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為稀釋體積，mL；V2為樣品溶液體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，mg；V3為取樣體積，mL。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

橫坐標(biāo)（X）為蘆丁質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)（Y）為吸光度值，繪制蘆丁標(biāo)線如圖1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of rutin

由圖1可知，蘆丁標(biāo)線為Y=9.324 3X+0.000 6，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 6。該標(biāo)線在0～0.01 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

1.4.4 山竹殼中總黃酮的提取單因素試驗(yàn)

分別以液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波提取時(shí)間、微波功率為影響因素，設(shè)置4個(gè)因素的不同水平，分析不同提取條件對(duì)山竹殼中總黃酮提取率的影響。

1.4.5 正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素四水平正交試驗(yàn)，水平因素表見(jiàn)表1。

表1 水平因素表Table 1 Table of levels and factors

2 山竹殼中總黃酮抗氧化試驗(yàn)

2.1 超氧陰離子自由基的清除

參照林海祿等[16-17]方法，測(cè)定超氧陰離子自由基清除率。取不同體積分?jǐn)?shù)樣品液1.00 mL，各加入4.50 mL Tris-HCl緩沖液和0.10 mL鄰苯三酚，反應(yīng)5 min后加入1.00 mL HCl溶液終止反應(yīng)，混勻，以蒸餾水作參比，測(cè)定（299 nm）吸光度值。超氧陰離子自由基清除率公式為：

式中：A1為樣品液和含鄰苯三酚溶液的吸光度值；A2為不含鄰苯三酚溶液樣品液的吸光度值；A3為含鄰苯三酚溶液的吸光度值。

2.2 DPPH自由基的去除

參照孫建華等[18-21]方法，采用DPPH自由基測(cè)定山竹殼的抗氧化效果。配制濃度是0.20 mg/mL DPPH溶液，低溫陰涼處保存。取不同濃度的樣品2.00 mL，加入DPPH溶液，混勻，在暗處反應(yīng)30 min左右。以無(wú)水乙醇做參比，測(cè)定（515 nm）吸光度值。去除率公式為：

式中：Ai為DPPH溶液吸光度值；Ax為樣品液和DPPH溶液吸光度值；Ae為不含DPPH溶液時(shí)樣品液吸光度值。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

參照王彥平等[22]方法，采用origin8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)制圖，單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

3.1.1 液料比對(duì)山竹殼中總黃酮提取率的影響

液料比對(duì)山竹殼中總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 液料比對(duì)山竹殼中總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of liquid ratio on the extraction rate of flavonoids in Mangosteen

由圖 2 知，液料比在 30∶1（mL/g）之前，30∶1（mL/g）之后隨提取率的上升而下降。液料比為30∶1（mL/g）時(shí)，提取率最高。推測(cè)可能是樣品吸水充分溶脹，與溶劑的接觸面積增加，導(dǎo)致總黃酮的提取率有所上升。因此，液料比選擇 30∶1（mL/g）。

3.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山竹殼中總黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山竹殼中總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山竹殼中總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of concentration of ethanol on the extraction rate of flavonoids in Mangosteen

由圖3知，提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而先上升后下降，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)，提取率最高，提取率降低的原因可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，不利于總黃酮類物質(zhì)的溶解。此外，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，會(huì)溶出醇溶性的雜質(zhì)、色素和脂類物質(zhì)影響總黃酮的提取率。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇75%。

3.1.3 微波提取時(shí)間對(duì)山竹殼中總黃酮提取率的影響

微波輔助提取時(shí)間對(duì)山竹殼中總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 微波輔助提取時(shí)間對(duì)山竹殼中總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction assisted extraction of flavonoids in Mangosteen extract time

由圖4知，提取率隨提取時(shí)間的增加而先上升后下降，提取率在3 min時(shí)達(dá)到最高，提取率下降的原因是時(shí)間的增加，使溫度升高，導(dǎo)致乙醇揮發(fā)較快。因此，提取時(shí)間選擇3 min。

3.1.4 微波功率對(duì)山竹殼中總黃酮提取率的影響

微波功率對(duì)山竹殼中總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 微波功率對(duì)山竹殼中總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction power on the extraction of flavonoids in Mangosteen

由圖5知，提取率隨微波功率增加而先上升后下降，當(dāng)微波功率為300 W時(shí)，提取率最高，提取率下降的原因可能是乙醇揮發(fā)較快，山竹殼中總黃酮物質(zhì)不能充分被溶解。因此，微波功率選擇300 W。

3.2 山竹殼中黃酮提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 山竹殼中總黃酮提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Optimization results of orthogonal test and analysis of extraction conditions of flavonoids in Mangosteen

試驗(yàn)結(jié)果顯示，總黃酮的提取率受各因素的影響次序：乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）＞微波功率（D）＞微波提取時(shí)間（B）＞液料比（C）。最佳方案是A1D2C3B2，即乙醇體積分?jǐn)?shù) 75%，微波提取時(shí)間 3 min，液料比 35 ∶1（mL/g），微波功率300 W。該試驗(yàn)條件沒(méi)有出現(xiàn)在正交試驗(yàn)中，需要進(jìn)行驗(yàn)證，依照上述試驗(yàn)條件平行3次試驗(yàn)，取算數(shù)平均值結(jié)果如下：提取率分別是12.05%、12.10%、11.92%，得出山竹殼中總黃酮類物質(zhì)提取率為12.02%，與正交試驗(yàn)相符合。因此為最佳試驗(yàn)條件，說(shuō)明此方案可實(shí)施性較強(qiáng)。

3.3 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 超氧陰離子自由基的清除

考察山竹殼中總黃酮類物質(zhì)對(duì)超氧陰離子自由基的去除能力，當(dāng)提取液質(zhì)量濃度在4.00 mg/mL時(shí)自由基的去除率最高達(dá)到72.34%，證明山竹殼總黃酮類物質(zhì)具有較好的抗氧化性。

3.3.2 DPPH自由基的去除

考察山竹殼中總黃酮類物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的去除能力，當(dāng)提取液質(zhì)量濃度在10.00 mg/mL時(shí)自由基的去除率最高達(dá)到68.52%，也證明了山竹殼中總黃酮類物質(zhì)具有較好的抗氧化性。

4 結(jié)論

1）用微波法提取山竹殼中的總黃酮，最佳試驗(yàn)條件：乙醇體積分?jǐn)?shù) 75%、液料比 35 ∶1（mL/g）、微波提取時(shí)間3 min，微波功率300 W，此條件下，總黃酮提取率算數(shù)平均值為12.02 mg/g。

2）研究發(fā)現(xiàn)山竹殼總黃酮提取液對(duì)超氧陰離子自由基清除率最高達(dá)到72.34%，對(duì)DPPH自由基清除率最高達(dá)到68.52%，證明該提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力。