顧冰飛，趙圓圓，陳義勇

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500）

鋅是生物體正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量元素之一，是很多種酶的活性中心物質(zhì)，發(fā)揮著催化和調(diào)節(jié)的作用[1]。研究表明，缺鋅會(huì)導(dǎo)致兒童發(fā)育遲緩[2]、心血管疾病[3]、學(xué)習(xí)記憶能力降低[4]等。目前補(bǔ)鋅劑多以無(wú)機(jī)形式存在，無(wú)機(jī)鋅不易吸收且攝入過多會(huì)產(chǎn)生一定的毒害作用，與無(wú)機(jī)鋅相比，有機(jī)鋅易被人體吸收且生物學(xué)效價(jià)高[5]。近年來(lái)，多糖鋅螯合物作為一種有機(jī)鋅補(bǔ)充劑成為研究熱點(diǎn)，目前報(bào)道的通過人工合成的多糖鋅螯合物如金針菇多糖-Zn2＋螯合物[6-7]、肉蓯蓉多糖鋅[8]、蛹蟲草基質(zhì)多糖鋅配合物[9]、酵母多糖鋅配合物[10]、豬苓多糖鋅配合物[11]等，研究發(fā)現(xiàn)這些人工合成的多糖鋅復(fù)合物有望被開發(fā)成一種新型補(bǔ)鋅劑。

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹側(cè)耳，隸屬傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，是一種珍貴食用菌[12]。多糖是杏鮑菇主要成分之一，目前對(duì)杏鮑菇多糖（Pleurotus eryngii polysaccharides，PEP）研究主要集中在生物活性如抗腫瘤[13-14]、降血糖[15]、抑菌[16]、保濕[17]、抗疲勞[18]、提高免疫力[19]等及提取[20-23]、乙?；揎梉24]、羧甲基化修飾[25]等方面。金屬離子如 Fe2＋、Co2＋、Cu2＋、Zn2＋等對(duì)硬軟配體都有一定親和性，能分別與軟硬離子競(jìng)爭(zhēng)配體形成絡(luò)合物[26]。多糖與鋅離子的螯合原理主要是由于多糖中的-OH和-COO-與鋅離子發(fā)生了配位[8]。但對(duì)于杏鮑菇多糖與微量元素的螯合及其生物活性的研究尚未見報(bào)道。

因此本研究以PEP為對(duì)象，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化杏鮑菇多糖鋅螯合物（Pleurotus eryngii polysaccharides-zinc（II）chelate，PEP-Zn）的制備工藝，通過紅外光譜PEP和PEP-Zn結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步表征，并對(duì)PEP和PEP-Zn的抗氧化性進(jìn)行研究，為開發(fā)杏鮑菇多糖鋅螯合物這一新型具有抗氧化活性的補(bǔ)鋅劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇：常熟市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；DPPH：深圳欣博盛生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷：蘇州亞科科技股份有限公司；硫酸鋅、水楊酸、焦性沒食子酸、過氧化氫、無(wú)水乙醇、鹽酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器：金壇市友聯(lián)儀器研究所；722型數(shù)顯可見分光光度計(jì)：上海光學(xué)儀器五廠有限公司；小型高速粉碎機(jī)：山東維諾醫(yī)藥設(shè)備制造有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：北京成萌偉業(yè)科技有限公司；HH-2智能數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司；SHB-B95循環(huán)水式多用真空泵：鄭州世紀(jì)雙科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀：日本島津公司；TAS-990原子吸收分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 PEP的制備

杏鮑菇經(jīng)過洗滌、干燥、粉碎過篩，按料液比1∶30（g/mL）將杏鮑菇粉和蒸餾水混合，90℃熱水浸提 3 h，離心（4 000 r/min，10 min）后合并上清液，用Sevage法[27]除去上清液中的蛋白，離心后收集上清液，然后加入4倍體積的95%乙醇，4℃醇沉24 h后離心（4 500 r/min，15min），將沉淀冷凍干燥得到 PEP。

1.3.2 PEP-Zn的制備

PEP-Zn的制備參考黃靖等[8]的方法并根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行調(diào)整。準(zhǔn)確稱取0.25 g杏鮑菇多糖溶于100 mL蒸餾水，充分溶解得到2.5 g/L的多糖溶液。取25 mL多糖溶液然后加入等體積的ZnSO4溶液（0.15 mol/L），調(diào)節(jié)混合液pH值為5，然后50℃條件下攪拌反應(yīng)3 h。反應(yīng)液經(jīng)流水透析48 h，透析液經(jīng)冷凍干燥后得到PEP-Zn。

1.3.3 PEP-Zn螯合率的測(cè)定

鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別配置濃度為 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mg/L 的 ZnSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，用火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定，橫、縱坐標(biāo)分別為鋅離子濃度和吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程：Y=0.272 1X+0.05，R2=0.978 1，式中：Y為吸光度；X為鋅離子濃度，mg/L。

將PEP-Zn溶于1L蒸餾水，充分溶解。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)及鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)，將溶液稀釋10倍。稀釋液經(jīng)過濾，用火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定，根據(jù)吸光度得出螯合前和螯合后鋅離子濃度（mg/L），分別記為C0和C，根據(jù)以下公式計(jì)算螯合率：

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 螯合時(shí)間對(duì)PEP-Zn螯合率的影響

取25mL杏鮑菇多糖溶液（2.5g/L）和等體積硫酸鋅溶液（0.15mol/L），將兩者混合均勻，調(diào)節(jié)混合溶液pH值為5，螯合溫度為50℃，考察不同螯合時(shí)間（2、3、4、5 h）對(duì)PEP-Zn螯合率的影響，確定最佳螯合時(shí)間。

1.3.4.2 螯合溫度對(duì)PEP-Zn螯合率的影響

取25 mL杏鮑菇多糖溶液（2.5 g/L）和等體積硫酸鋅溶液（0.15 mol/L），將兩者混合均勻，調(diào)節(jié)混合溶液pH值為5，螯合時(shí)間為3 h，考察不同螯合溫度（40、50、60、70℃）對(duì)PEP-Zn螯合率的影響，確定最佳螯合溫度。

1.3.4.3 螯合pH值對(duì)PEP-Zn螯合率的影響

取25 mL杏鮑菇多糖溶液（2.5 g/L）和等體積硫酸鋅溶液（0.15 mol/L），將兩者混合均勻，螯合時(shí)間為3 h，螯合溫度為 50 ℃，考察不同螯合 pH 值（4、5、6、7）對(duì)PEP-Zn螯合率的影響，確定最佳螯合pH值。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，采用Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)螯合時(shí)間、螯合溫度、螯合pH值三因素三水平的回歸方程以擬合各因素與響應(yīng)值螯合率的關(guān)系，利用Design-Expert 8.0.6軟件系統(tǒng)進(jìn)行響應(yīng)面分析，以得到PEP-Zn的最優(yōu)制備工藝。

1.3.6 PEP及PEP-Zn的結(jié)構(gòu)表征

將PEP和PEP-Zn粉末充分干燥后，分別取5 mg與KBr充分混勻后壓片，進(jìn)行紅外光譜掃描。波數(shù)范圍 400 cm-1～4 000 cm-1，對(duì) PEP 與 PEP-Zn 的紅外光譜圖進(jìn)行對(duì)比分析。

1.3.7 抗氧化活性測(cè)定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

配置0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存?zhèn)溆?。在試管中分別加入不同濃度的PEP和PEP-Zn溶液 （0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）2.0 mL 以 及 2.0 mL DPPH溶液，搖勻、室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm處進(jìn)行吸光度測(cè)定，2 mL蒸餾水分別代替PEP和PEP-Zn溶液及2 mL DPPH乙醇溶液（0.1 mmol/L）反應(yīng)作為空白參比，測(cè)定OD517值，以蒸餾水作參比調(diào)零[28]。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：A1為蒸餾水替代DPPH測(cè)得的吸光度；A2為不同濃度PEP及PEP-Zn測(cè)得的吸光度；A3為蒸餾水替代PEP及PEP-Zn測(cè)得的吸光度。

1.3.7.2 羥基自由基清除能力的測(cè)定

配置9.0 mmol/L的FeSO4溶液，9.0 mmol/L的水楊酸乙醇溶液以及8.8 mmol/L的H2O2溶液備用。分別向各試管中加入1 mL的FeSO4、1 mL的水楊酸乙醇溶液，混勻后加入不同濃度的PEP和PEP-Zn溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）1.0 mL，再加入 1.0 mL H2O2啟動(dòng)反應(yīng)?；靹蚝笥?7℃水浴加熱反應(yīng)30 min，測(cè)定OD510值[29]。羥基自由基的清除率計(jì)算公式如下：

式中：A1為以蒸餾水代替水楊酸測(cè)得的吸光度；A2為不同濃度PEP及PEP-Zn測(cè)得的吸光度；A3為以蒸餾水代替不同濃度PEP及PEP-Zn測(cè)得的吸光度。

1.3.7.3 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

配置 50 mmol/L，pH 8.2的 Tris-HCl緩沖液，7 mmol/L焦性沒食子酸溶液，10 mol/L HCl溶液備用。向試管中加入4.5 mL Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 8.2），1 mL不同濃度的PEP及PEP-Zn溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）以及 3.2 mL 蒸餾水，混勻后于25℃水浴20 min。隨后加入0.3 mL鄰苯三酚溶液（7 mmol/L），搖勻，25℃水浴加熱3 min后立即滴入1滴HCl（10 mol/L）溶液終止反應(yīng)，測(cè)定OD325值[30]。超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式如下。

式中：A為不同濃度PEP及PEP-Zn測(cè)得的吸光度；A0為以蒸餾水代替不同濃度PEP及PEP-Zn測(cè)得的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEP-Zn的制備工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1.1 螯合時(shí)間對(duì)PEP-Zn螯合率的影響

螯合時(shí)間對(duì)PEP-Zn螯合率的影響見圖1。

圖1 螯合時(shí)間對(duì)PEP-Zn螯合率的影響Fig.1 Effect of chelating time on the chelation rate of PEP-Zn

根據(jù)圖1，螯合時(shí)間對(duì)PEP-Zn的螯合率影響較為顯著。在2 h～4 h，隨著螯合時(shí)間不斷增長(zhǎng)，螯合率顯著上升。螯合時(shí)間達(dá)到4 h時(shí)，螯合率達(dá)到最大值53.6%。超過4 h后，隨著螯合時(shí)間的增長(zhǎng)，螯合率逐步表現(xiàn)出下降勢(shì)態(tài)。其主要原因在于延長(zhǎng)了螯合時(shí)間，促使PEP與硫酸鋅兩者有了更為緊密的接觸反應(yīng)，使得螯合率不斷升高。但是螯合時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，在一定程度上破壞了體系的穩(wěn)定性，使其副反應(yīng)的發(fā)生率增高，導(dǎo)致部分配合物開始解離，從而造成螯合率的顯著降低[25]。因此PEP-Zn制備的最佳螯合時(shí)間為4 h。

2.1.1.2 螯合溫度對(duì)PEP-Zn螯合率的影響

螯合溫度對(duì)PEP-Zn螯合率的影響見圖2。

根據(jù)圖2可知，螯合溫度對(duì)PEP-Zn螯合率影響較為顯著。在40℃～60℃之間，隨著螯合溫度持續(xù)升高的情況下，螯合率呈現(xiàn)出不斷增長(zhǎng)的趨勢(shì)。溫度在60℃的條件下，螯合率升到最大值44.9%。但是當(dāng)螯合溫度大于60℃并繼續(xù)升高時(shí)，螯合率表現(xiàn)出下降的態(tài)勢(shì)。主要原因可能是，螯合溫度在一定范圍內(nèi)增加，促進(jìn)PEP的溶脹，利于ZnSO4滲透到多糖顆粒內(nèi)部，分子間有效碰撞的幾率得到增加，使得螯合率顯著增大。溫度超過60℃后，過高的溫度易導(dǎo)致PEP的分解，反而降低了螯合效率。因此PEP-Zn制備的最佳螯合溫度為60℃。

圖2 螯合溫度對(duì)PEP-Zn螯合率的影響Fig.2 Effect of chelating temperature on the chelation rate of PEP-Zn

2.1.1.3 螯合pH值對(duì)PEP-Zn螯合率的影響

螯合pH值對(duì)PEP-Zn的影響如圖3所示。

圖3 螯合pH對(duì)PEP-Zn螯合率的影響Fig.3 Effect of chelating pH on the chelation rate of PEP-Zn

當(dāng)螯合pH值在4.0～7.0范圍內(nèi)，隨著pH值的增大，螯合率先上升后下降。pH值為5時(shí)，螯合率達(dá)到最大值43.7%。pH值為7時(shí)，產(chǎn)生了Zn（OH）2沉淀，不利于螯合反應(yīng)的進(jìn)行。因此PEP-Zn制備的最佳螯合pH值為5。

2.1.2 PEP-Zn制備工藝條件優(yōu)化

2.1.2.1 響應(yīng)模型的建立與分析

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以螯合率為指標(biāo)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平取值見表1，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值螯合率結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

利用Design-Expert 8.0.6對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在對(duì)各因素進(jìn)行回歸分析后得到響應(yīng)值螯合率（Y）對(duì)螯合時(shí)間（A）、螯合溫度（B）、pH值（C）的三元二次回歸方程：

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平取值Table 1 Factors and levels designed for response surface analysis

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及螯合率響應(yīng)值Table 2 Box-Behnken design with response values for chelation rate

表3 回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

由表3方差分析結(jié)果可知，本試驗(yàn)所選用的模型極顯著（P＜0.001），且方程失擬項(xiàng)不顯著（P=0.293 9＞0.05），說明未知因素對(duì)試驗(yàn)影響較小，此模型合適本試驗(yàn)。R2=0.994 0，表明該模型具有相對(duì)較優(yōu)的擬合程度，在評(píng)估相關(guān)因素對(duì)PEP-Zn螯合率的影響時(shí)較為準(zhǔn)確，可用來(lái)對(duì)PEP-Zn制備工藝研究進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)C因素對(duì)螯合率的線性效應(yīng)極為顯著（P＜0.001），交互項(xiàng) AB、AC、BC 及二次項(xiàng) A2、B2、C2對(duì)響應(yīng)值螯合率均有顯著影響（P＜0.001）。

2.1.2.2 響應(yīng)面圖分析

圖4～圖6中的響應(yīng)面三維模型圖顯示了螯合時(shí)間、螯合溫度和螯合pH值中任意選取一個(gè)變量為零水平時(shí)，另外兩個(gè)變量對(duì)PEP-Zn螯合率的影響，據(jù)此可分析各影響因素對(duì)PEP-Zn螯合率的影響及兩因素間的交互作用。

圖4 螯合時(shí)間和螯合溫度對(duì)螯合率的影響Fig.4 Effect of chelating time and chelating temperature on chelation rate

圖5 螯合時(shí)間和螯合pH值對(duì)螯合率的影響Fig.5 Effect of chelating time and chelating pH on chelation rate

由圖4～圖6可知，當(dāng)一個(gè)因素取零水平時(shí)，另外兩個(gè)因素同時(shí)發(fā)生變化，隨著兩因素變量的加大，PEP-Zn螯合率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。螯合時(shí)間與螯合pH值、螯合溫度與pH值及螯合時(shí)間與螯合溫度之間的交互作用非常顯著。

圖6 螯合溫度和螯合pH值對(duì)螯合率的影響Fig.6 Effect of chelating temperature and chelating pH on chelation rate

2.1.2.3 最佳工藝條件確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)Design-Expert.V8.0.6軟件得到分析數(shù)據(jù)，可知PEP-Zn制備工藝的最佳工藝條件：螯合時(shí)間為3.73 h，螯合溫度為58.50℃，螯合pH值為4.29，在該條件下，PEP-Zn螯合率預(yù)測(cè)值為64.3%。

為確保試驗(yàn)的可行性，驗(yàn)證試驗(yàn)采取的工藝條件適當(dāng)調(diào)整為，螯合時(shí)間為4 h，螯合溫度為58℃，螯合pH值為4，在該工藝條件下測(cè)得PEP-Zn的螯合率為63.8%，與預(yù)測(cè)值相比，誤差較小，說明該模型可行。

2.2 PEP與PEP-Zn紅外光譜分析

PEP與PEP-Zn紅外光譜分析如圖7所示。

圖7PEP與PEP-Zn紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectra of PEP and PEP-Zn

PEP與PEP-Zn都具有多糖類物質(zhì)的紅外特征峰，在3 440 cm-1強(qiáng)峰為O-H的伸縮振動(dòng)峰，在2 900 cm-1波數(shù)處是C-H的伸縮振動(dòng)峰，與PEP相比，PEP-Zn的吸收峰有所減弱。在1 600 cm-1及1 384 cm-1波數(shù)處，PEP表現(xiàn)出異常顯著的C=O伸縮振動(dòng)，而PEP-Zn在這兩處的吸收峰都有所減弱，揭示Zn2+可能與羧酸或羧酸鹽之間形成了配位鍵，且Zn2+多與C=O基團(tuán)發(fā)生配位反應(yīng)，加上羥基參與反應(yīng)，形成強(qiáng)烈的氫鍵締合，加強(qiáng)了分子間作用。由于紅外光譜給出的結(jié)構(gòu)信息僅僅是相關(guān)官能團(tuán)連接方式及類型[31]，對(duì)PEP-Zn的結(jié)構(gòu)反映不全面，因此對(duì)其結(jié)構(gòu)需要進(jìn)一步研究。

2.3 PEP與PEP-Zn的抗氧化活性

2.3.1 PEP與PEP-Zn對(duì)DPPH自由基的清除作用

PEP與PEP-Zn對(duì)DPPH自由基的清除作用見圖8。

圖8PEP和PEP-Zn對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.8 DPPH radicals scavenging effect of PEP and PEP-Zn

從圖8可知，PEP、PEP-Zn兩者對(duì)DPPH自由基清除作用明顯，且在濃度不斷增大的條件下，清除作用也隨之增強(qiáng)。與PEP相比，PEP-Zn對(duì)DPPH自由基清除作用減弱，原因可能與結(jié)合鋅離子位點(diǎn)的數(shù)目及結(jié)合強(qiáng)度有關(guān)，導(dǎo)致PEP分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而導(dǎo)致PEP-Zn對(duì)DPPH自由基清除作用降低，具體原因還需進(jìn)一步研究。

2.3.2 PEP與PEP-Zn對(duì)羥基自由基的清除作用

PEP與PEP-Zn對(duì)羥基自由基的清除作用見如圖9所示。

圖9 PEP和PEP-Zn對(duì)羥基自由基的清除作用Fig.9 Hydroxyl radicals scavenging effect of PEP and PEP-Zn

當(dāng)多糖濃度低于1 mg/mL時(shí)，PEP及PEP-Zn對(duì)羥基自由基的清除作用隨著濃度增大而增強(qiáng)。PEP與PEP-Zn對(duì)羥基自由基最大清除率分別達(dá)到33.8%和42.2%，PEP-Zn對(duì)羥基自由基的清除率較PEP有顯著提升?？赡苁且?yàn)镻EP-Zn與鋅配合后，導(dǎo)致配位部分增強(qiáng)與暴露的活性基團(tuán)之間的作用，進(jìn)而促進(jìn)與自由基的作用增大[32]。

2.3.3 PEP與PEP-Zn對(duì)超氧陰離子（O2-·）的自由基清除作用

PEP與PEP-Zn對(duì)超氧陰離子（O2-·）的自由基清除作用如圖10所示。

圖10 PEP和PEP-Zn對(duì)超氧陰離子（O2-·）自由基的清除作用Fig.10 Superoxide anion（O2-·）free radicals scavenging effect of PEP and PEP-Zn

當(dāng)多糖濃度低于1 mg/mL時(shí)，PEP和PEP-Zn對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用隨濃度增大而增強(qiáng)。PEP與PEP-Zn對(duì)超氧陰離子自由基的最大清除率值分別達(dá)到14.1%和27%。PEP-Zn對(duì)O2-·自由基的清除能力比PEP有明顯的提升，這可能是由于PEP與鋅配合后，與自由基反應(yīng)生成的中間體可能更加穩(wěn)定，導(dǎo)致清除自由基的能力增大[33]。由此可見，對(duì)PEP進(jìn)行鋅離子的螯合有利于提升其對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力。

3 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化確定了PEP-Zn制備工藝的最佳工藝條件為：螯合時(shí)間為3.73 h，螯合溫度為58.5℃，螯合pH值為4.29，在該條件下，PEP-Zn螯合率為64.3%。與PEP相比，PEP-Zn對(duì)DPPH自由基清除作用減弱，對(duì)羥基自由基和超氧陰離子的清除率增強(qiáng)，修飾后抗氧化活性變化的機(jī)理還不是很清楚，還需進(jìn)一步深入研究，本研究成果為開發(fā)PEP-Zn作為一種新型的具有抗氧化活性的補(bǔ)鋅劑提供了一定的理論依據(jù)。