張蜀艷，蒲建萍，李政

（1.成都工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川成都610051；2.四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院，四川自貢643000；3.成都市科技發(fā)展研究中心，四川成都610051）

白花蛇舌草和半枝蓮藥物作為一種中藥配方，藥用價值極高。兩者均富含活性多糖、生物堿、黃酮類化合物、甾體皂苷和多酚類等化學(xué)物質(zhì)，而且同時具備清熱解毒、消腫化瘀、利尿除濕、消除各類炎癥等藥理作用[1]。文獻(xiàn)證明，白花蛇舌草和半枝蓮對于治療肝癌、胃癌、直腸癌以及鼻咽癌具有較好的功效[2]。黃酮類化合物作為廣泛存在于白花蛇舌草和半枝蓮中的一類活性藥用成分，在防治心腦血管疾病、抗癌抗腫瘤、消除人體自由基等方面具有較好的功效[3]。

目前，關(guān)于白花蛇舌草和半枝蓮藥物應(yīng)用的研究主要集中于提高免疫力和抗癌抗腫瘤兩大方向[4]，但關(guān)于白花蛇舌草和半枝蓮藥物活性成分作用機(jī)理的研究鮮有報道。本研究擬通過質(zhì)量比為1∶1的半枝蓮/白花蛇舌草配伍方為試驗材料，對其總黃酮類化合物提取條件進(jìn)行優(yōu)化研究，從而為進(jìn)一步探索黃酮類保健食品開發(fā)路徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白花蛇舌草：武漢中藥材飲片有限公司；半枝蓮：湖北聚瑞中藥飲片有限公司。白花蛇舌草與半枝蓮均于60℃條件下進(jìn)行恒溫干燥至恒重，冷卻至常溫后，過50目篩進(jìn)行粉碎，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：北京科興生物制品有限公司；無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、雙氧水、水楊酸、無水乙醇、丙酮、無水乙醚，硫酸亞鐵、鄰三苯酚（均為分析純）：上海實驗試劑有限公司。

UV1300型紫外可見分光光度計：成都信立邦生物制藥有限公司；FA2004B型電子天平：上海精密儀器儀表有限公司；YRE-2050A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上?，斈醿x器設(shè)備有限公司；DFY-200C型高速粉碎機(jī)：上海利聞科學(xué)儀器有限公司；J-HH-6A型精密數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海勝衛(wèi)電子科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，將其溶解于70%的乙醇溶液當(dāng)中，量筒定容至100 mL，此時可獲得濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。取6個25 mL的容量瓶，分別按照順序準(zhǔn)確加入 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。之后，分別加入5%的亞硝酸鈉溶液1.5 mL，混合均勻，靜置6 min；分別加入10%的硝酸鋁溶液2 mL，混合均勻，靜置6 min；分別加入4%的氫氧化鈉溶液2 mL，混合均勻，靜置1 min；最后，用70%乙醇溶液定容，混合均勻，靜置15 min[5]。將6個樣品于510 nm波長處測定吸光度，重復(fù)3次，取平均值。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為：A=0.189 7C－0.198 6，R2=0.997 9。

1.2.2 試驗樣品制備及總黃酮得率測定

稱取一定質(zhì)量的白花蛇舌草、半枝蓮，粉碎并過40目篩，各取10.0 g，于磨口三角燒瓶中混合均勻，形成試驗樣品。在超聲波清洗器中，按照試驗設(shè)定的時間進(jìn)行浸提，過濾除去殘留物；濾液在90℃條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮；以乙醇為溶液，按照試驗設(shè)定的液固比、乙醇濃度進(jìn)行醇沉，醇沉1 h；醇沉產(chǎn)物在離心機(jī)中，按照4 000 r/min離心處理15 min；離心處理后產(chǎn)物依次采用無水乙醇、丙酮、無水乙醚進(jìn)行洗滌，每樣試劑洗滌3次；將所得濾渣溶解于濃度為70%的乙醇溶液當(dāng)中，并定容至50 mL，作為待測樣品。之后按照1.2.1中所述方法，進(jìn)行吸光度測定，并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得總黃酮得率。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 乙醇濃度的確定

固定液固比為70∶1（mL/g）、提取時間為3 h的基礎(chǔ)因素條件，研究不同乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%）對總黃酮得率的影響及變化規(guī)律。

1.2.3.2 液固比的確定

固定乙醇濃度為70%、提取時間為3 h的基礎(chǔ)因素條件，研究不同液固比[50 ∶1、60 ∶1、70 ∶1、80 ∶1、90∶1（mL/g）]對總黃酮得率的影響及變化規(guī)律。

1.2.3.3 提取時間的確定

固定乙醇濃度為70%、液固比為70∶1（mL/g）的基礎(chǔ)因素條件，研究不同提取時間（1、2、3、4、5 h）對總黃酮得率的影響及變化規(guī)律。

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)行響應(yīng)面試驗，以乙醇濃度（X1）、液固比（X2）、提取時間（X3）為自變量，總黃酮得率（Y）為響應(yīng)面值，制定總黃酮提取工藝的三因素三水平響應(yīng)面法試驗設(shè)計方案，因素水平表見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Encode table of factors and levels

1.2.5 抗氧化性研究

1.2.5.1 羥基自由基清除率的測定

取6只試管，分別按照順序加入12 mol/L的FeSO4溶液、12 mol/L的水楊酸溶液各2 mL。1號試管為對照空白樣品，加入2 mL蒸餾水，2號～6號試管分別加入濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的黃酮提取液各2 mL，然后在1號～6號試管中加入2 mL濃度為3%的H2O2溶液，用溫度為40℃的恒溫水浴鍋反應(yīng)25 min，反應(yīng)結(jié)束后，于波長510 nm處，測定吸光度。其中，1號試管計為空白對照樣品的吸光度AO，2號～6號試管計為待測溶液樣品的吸光度AX。采用同樣的方法，將2號～6號試管的H2O2溶液改為蒸餾水，測定吸光度，計為待測溶液樣品的底吸光度AXO[6]。羥基自由基清除率計算公式為：

羥基自由基清除率/%=[AO-（AX-AXO）]/AO×100

式中：AO為空白對照樣品的吸光度；AX為待測溶液樣品的吸光度；AXO為待測溶液樣品的底吸光度。1.2.5.2 超氧陰離子自由基清除率的測定

取6只試管，分別加入濃度為0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）5 mL，37℃的恒溫水浴鍋反應(yīng)20 min。1號試管為對照空白樣品，加入2 mL蒸餾水，2號～6 號試管分別加入濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的黃酮提取液各2 mL，然后在1號～6號試管中加入0.5 mL濃度為0.025 mol/L的鄰苯三酚溶液，均勻混合后，37℃恒溫水浴鍋反應(yīng)6 min，最后加入1 mL 0.1 mol/L的HCl溶液終止反應(yīng)，于波長320 nm處，測定吸光度。其中，1號試管計為空白對照樣品的吸光度AO，2號～6號試管計為待測溶液樣品的吸光度AX[7]。超氧陰離子自由基清除率計算公式為：

超氧陰離子自由基清除率/%=（AO-AX）/AO×100

1.3 模型構(gòu)建與數(shù)據(jù)分析

利用Design-expert8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面法回歸模型的構(gòu)建以及模型結(jié)果的分析[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇濃度對總黃酮得率的影響

乙醇濃度對總黃酮得率的影響見圖1。

通過圖1分析發(fā)現(xiàn)，在乙醇濃度為50%～70%的范圍內(nèi)，總黃酮得率隨著乙醇濃度的升高而增加；在乙醇濃度為70%～90%的范圍內(nèi)，總黃酮得率隨著乙醇濃度的升高呈現(xiàn)出下降的趨勢。出現(xiàn)這樣的變化趨勢主要是因為當(dāng)乙醇濃度過低時，黃酮類物質(zhì)容易提取不充分，而當(dāng)乙醇濃度過高時，黃酮類物質(zhì)提取趨于飽和，從而使得總黃酮得率出現(xiàn)下降[9]。在乙醇濃度試驗設(shè)定范圍內(nèi)，當(dāng)乙醇濃度為70%時，總黃酮得率達(dá)到最高，為6.85%。因此，在響應(yīng)面法試驗設(shè)計方案中，乙醇濃度的基量水平應(yīng)當(dāng)為70%為宜。

圖1 乙醇濃度對總黃酮得率的影響Fig.1 The effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

2.1.2 液固比對總黃酮得率的影響

液固比對總黃酮得率的影響見圖2。

圖2 液固比對總黃酮得率的影響Fig.2 The effect of ratio of liquid to solid on the yield of total flavonoids

通過圖2分析發(fā)現(xiàn)，在液固比為50∶1（mL/g）～60∶1（mL/g）的范圍內(nèi)，總黃酮得率隨著液固比的增加而增加；在液固比為 60 ∶1（mL/g）～90 ∶1（mL/g）的范圍內(nèi)，總黃酮得率隨著液固比的增加而緩慢下降。出現(xiàn)這樣的變化趨勢可能是因為提取的黃酮類物質(zhì)會在液固比60∶1（mL/g）的情況下達(dá)到飽和狀態(tài)，如果進(jìn)一步增大液固比會稀釋提取的黃酮類物質(zhì)的濃度，從而造成總黃酮得率的下降[10]。在液固比試驗設(shè)定范圍內(nèi)，當(dāng)液固比為60∶1（mL/g）時，總黃酮得率達(dá)到最高，為6.62%。因此，在響應(yīng)面法試驗設(shè)計方案中，液固比的基量水平應(yīng)當(dāng)為60∶1（mL/g）為宜。

2.1.3 浸提時間對總黃酮得率的影響

浸提時間對總黃酮得率的影響見圖3。

通過圖3分析發(fā)現(xiàn)，在浸提時間為2 h～4 h的范圍內(nèi)，總黃酮得率隨著浸提時間的延長而增加；在浸提時間為4 h～5 h的范圍內(nèi)，總黃酮得率隨著浸提時間的延長而緩慢下降。通常情況下，總黃酮得率與浸提時間之間會存在一個時間平衡點，而低于或超出這個時間平衡點，都會導(dǎo)致總黃酮得率的下降[11]。在浸提時間試驗設(shè)定范圍內(nèi)，當(dāng)浸提時間為4 h時，總黃酮得率達(dá)到最高，為6.59%。因此，在響應(yīng)面法試驗設(shè)計方案中，浸提時間的基量水平應(yīng)當(dāng)為4 h為宜。

圖3 浸提時間對總黃酮得率的影響Fig.3 The effect of extraction time on the yield of total flavonoids

2.2 響應(yīng)面工藝參數(shù)優(yōu)化試驗

2.2.1 優(yōu)化試驗方案

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，進(jìn)行響應(yīng)面法試驗設(shè)計。響應(yīng)面試驗設(shè)計組合及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計組合及結(jié)果Table 2 Design combination and result of response surface test

2.2.2 回歸模型構(gòu)建與方差分析

以乙醇濃度（X1）、液固比（X2）以及浸提時間（X3）為響應(yīng)面試驗設(shè)計基本參數(shù)，研究不同試驗因素組合對總黃酮得率（Y）的影響及其變化規(guī)律。表2已顯示出不同試驗因素組合條件下的總黃酮得率?；貧w方程的方差分析見表3。

回歸方程為：

表3 回歸方程的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of regression equation

由表3回歸方程的方差結(jié)果可知，F(xiàn)失擬=0.55＜F0.05（3，4）=6.59，說明響應(yīng)面法所建立的回歸方程失擬項不顯著，回歸方程可用于最優(yōu)試驗結(jié)果的選擇。同時，回歸方程的p＜0.000 1，說明回歸模型的F值表現(xiàn)為極顯著，即試驗數(shù)據(jù)與所采用的回歸方程模型預(yù)測結(jié)果基本相符[12]。回歸方程的偏回歸系數(shù)檢驗見表4。

表4 回歸方程的偏回歸系數(shù)檢驗結(jié)果Table 4 Test result of partial regression coefficient of regression equation

對表4回歸方程的偏回歸系數(shù)檢驗的結(jié)果進(jìn)行分析，可以得出如下結(jié)論：在3個試驗因素的一次項中，X1、X2、X3與Y均呈正相關(guān)，并且對Y的影響呈現(xiàn)出極顯著水平（p＜0.01）。在3個試驗因素的二次項中，X32與Y呈正相關(guān)；X12、X22與Y呈負(fù)相關(guān)。同時，3個試驗因素的二次項對Y的影響均呈現(xiàn)出極顯著水平（p＜0.01）。在3個試驗因素的交互項中，X1X3、X2X3與Y呈正相關(guān)；X1X2與Y呈負(fù)相關(guān)。其中，X1X2、X2X3對Y的影響呈現(xiàn)出極顯著水平（p＜0.01）；X1X3對Y的影響不顯著。

三因素之間兩兩交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖 4、圖 5、圖 6。

從這3張響應(yīng)面圖的等高線分布情況以及極值點出現(xiàn)情況可以看出，在3個試驗因素交互作用中存在理論上的極值[13]。對比3張響應(yīng)面圖中的3D曲線陡峭程度可知，X1與X2交互作用的3D曲線陡峭程度最為突出，這就表明，X1與X2的交互項對Y的影響相對于其它交互項的影響而言，更為顯著。同時，3張響應(yīng)面圖3D曲線陡峭程度也與表4中交互項的方差分析結(jié)果相一致。

圖4 乙醇濃度與液固比的響應(yīng)面和等高線分析圖Fig.4 The analysis diagram of the response surface and contour line between ethanol concentration and ratio of liquid to solid

圖5 乙醇濃度與浸提時間的響應(yīng)面和等高線分析圖Fig.5 The analysis diagram of the response surface and contour line between ethanol concentration and extraction time

圖6 液固比與浸提時間的響應(yīng)面和等高線分析圖Fig.6 The analysis diagram of the response surface and contour line between ratio of liquid to solid and extraction time

2.2.3 最優(yōu)試驗因素參數(shù)組合選擇與驗證試驗

利用Design-expert軟件包的極值分析工具對回歸方程進(jìn)行分析，由此可以獲得回歸方程極值點所對應(yīng)的試驗因素組合，即乙醇濃度73.92%、液固比70 ∶1（mL/g）、浸提時間 5 h，此時總黃酮得率能夠取得理論上的最大值7.33%?？紤]到試驗的實際可操作性，最佳的試驗因素組合取值應(yīng)為：乙醇濃度74%、液固比 70 ∶1（mL/g）、浸提時間 5 h。

用最佳的試驗因素組合進(jìn)行3次驗證試驗，分別測定所得樣品的總黃酮得率，3個樣品的總黃酮得率平均值為7.26%。理論上的總黃酮得率最大值為7.33%，實際獲得值與理論最大值的相對誤差為0.96%，在試驗誤差允許的范圍之內(nèi)，說明回歸方程擬合度較高，其最優(yōu)試驗因素參數(shù)組合選擇較為準(zhǔn)確[14]。

2.3 黃酮提取物抗氧化性試驗

2.3.1 羥基自由基清除試驗

黃酮提取液對羥基自由基的清除率結(jié)果見圖7。

圖7 黃酮提取液對羥基自由基的清除率Fig.7 Flavonoid extract on hydroxyl radical scavenging rate

羥基自由基氧化活性很強(qiáng)，會對人體細(xì)胞造成很大的危害，從而致使多種疾病的產(chǎn)生[15]。從圖7可以看出，在黃酮提取液質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL～0.4 mg/mL的范圍時，黃酮提取液對羥基自由基的清除率隨著總黃酮提取液質(zhì)量濃度的提升而增加，之后在黃酮提取液質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL～0.5 mg/mL的范圍時，黃酮提取液對羥基自由基的清除率略微下降。當(dāng)黃酮提取液質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時，黃酮提取液對羥基自由基的清除率達(dá)到最高，為57.16%。

2.3.2 超氧陰離子自由基清除試驗

黃酮提取液對超氧離子自由基的清除率結(jié)果見圖8。

盡管超氧陰離子自由基是人體內(nèi)存在的一種相對較弱的氧化劑，但它仍然會因為破壞人體細(xì)胞中的DNA和細(xì)胞膜而導(dǎo)致人體機(jī)體受損[16]。從圖8可以看出，在黃酮提取液質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL～0.3 mg/mL的范圍時，黃酮提取液對超氧離子自由基的清除率隨著黃酮提取液質(zhì)量濃度的提升而增加，之后在黃酮提取液質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL～0.5 mg/mL的范圍時，黃酮提取液對超氧離子自由基的清除率呈下降趨勢。當(dāng)黃酮提取液質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL時，黃酮提取液對超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到最高，為63.89%。

圖8 黃酮提取液對超氧離子自由基的清除率Fig.8 Flavonoid extract on superoxide anion radical scavenging rate

3 結(jié)論與討論

獲得較高總黃酮得率的最佳試驗因素參數(shù)組合為：乙醇濃度 74%、液固比 70∶1（mL/g）、浸提時間 5 h。在此條件下得到總黃酮得率的理論值為7.33%。通過驗證試驗測得實際總黃酮得率為7.26%，實際獲得值與理論最大值的相對誤差為0.96%，表明回歸方程結(jié)果可信，最優(yōu)試驗因素組合選擇較為準(zhǔn)確。

對提取的白花蛇舌草和半枝蓮中的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行抗氧化性試驗發(fā)現(xiàn)，提取后的黃酮類物質(zhì)對羥基自由基以及超氧陰離子自由基均具有較強(qiáng)的清除能力。其中，當(dāng)黃酮提取液質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時，黃酮提取液對羥基自由基的清除率達(dá)到最高，為57.16%；當(dāng)黃酮提取液質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL時，黃酮提取液對超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到最高，為63.89%。陳紅梅等[17]在研究超聲波輔助提取半枝蓮中的黃酮類物質(zhì)抗氧化性時，指出半枝蓮中的黃酮類物質(zhì)具有較強(qiáng)的還原力和羥基自由基清除效果。本試驗研究證明，經(jīng)過提取的白花蛇舌草和半枝蓮中的黃酮類糖依然具有較強(qiáng)的抗氧化性，這進(jìn)一步拓展了白花蛇舌草和半枝蓮中黃酮類物質(zhì)的應(yīng)用方向。