（渭南師范學(xué)院農(nóng)商學(xué)院，陜西省煤基低碳醇轉(zhuǎn)化工程研究中心，陜西渭南714099）

蝴蝶莢蒾（Viburnum plicatum）為忍冬科莢蒾屬落葉灌木，別名蝴蝶戲珠花、繡球花。其花色為白色或乳白色，花序邊緣有4～6朵不育花，極似群蝶飛舞而得名[1]。其果實多為倒卵形，常由綠色變?yōu)榧t色又轉(zhuǎn)為黑色?；ㄆ?月～5月，觀果期7月下旬至9月下旬，觀花觀果都具極高的觀賞價值[2-3]。目前關(guān)于莢蒾屬的報道主要集中在其栽培及觀賞價值的研究，而以蝴蝶莢蒾花為材料提取黃酮類色素的研究鮮有報道。黃酮類色素是一種生物活性物質(zhì)，具有較廣泛的藥用價值，其抗氧化性、抗衰老、抗癌、降低血糖血脂、降血壓等作用，可用來治療心腦血管疾病。此外，還具有消炎、殺菌、鎮(zhèn)痛等特點，對消化性潰瘍有保護作用[4-6]。本試驗以蝴蝶莢蒾花為材料，采用單因素試驗和正交試驗相結(jié)合提取蝴蝶莢蒾花總黃酮，以期為更好地開發(fā)利用蝴蝶莢蒾花提供試驗依據(jù)，為緩解藥用植物相對資源不足、開發(fā)可持續(xù)利用的藥用資源另辟蹊徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為蝴蝶莢蒾花，采自西安植物園。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所，純度98%；乙醇、NaNO2、Al（NO3）3·9H2O、NaOH（分析純）：上海生化制品有限公司。

1.2 儀器

755B紫外可見分光光度計、PHS-25雷磁pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；MC京制電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HH-8數(shù)字恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；Anke DI-4000B離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；DHG-9101恒溫鼓風(fēng)干燥箱：杭州浣熊儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法測定標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。精確稱取20 mg的蘆丁對照品（105℃干燥至恒重），用60%的乙醇溶解定容100 mL的容量瓶中，得到濃度為0.2 mg/mL的對照品溶液，將其作為儲備液備用。精密量取蘆丁對照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL，分別置于 25 mL 的容量瓶中，加質(zhì)量分數(shù)5%的亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，再加入質(zhì)量分數(shù)10%的硝酸鋁1 mL混勻，放置6 min后加入10 mL質(zhì)量分數(shù)4%的氫氧化鈉，再加蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置15 min，于510 nm波長處測定吸光值（以不加蘆丁的空白管為對照）。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 材料處理提取步驟

將采摘的蝴蝶莢蒾花，置于恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，45℃溫度下烘干至恒重，用研缽研碎備用。

稱取研碎的蝴蝶莢蒾花0.1 g置于25 mL的容量瓶中，加入一定體積分數(shù)的乙醇提取，離心取上清，加蒸餾水定容至刻度。精確吸取2.5 mL樣品，加入質(zhì)量分數(shù)為5%的NaNO21 mL，混勻，放置6 min，加質(zhì)量分數(shù)為10%的Al（NO3）31mL混勻，放置6 min，再加質(zhì)量分數(shù)為4%的NaOH 10 mL，立即加蒸餾水定容至25 mL，搖勻放置15 min，于最大吸收波長處測定吸光度；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算花中總黃酮含量，每個樣品重復(fù)3次求平均值。根據(jù)回歸方程計算提取物中黃酮的總量，并按下式計算蝴蝶莢蒾花瓣總黃酮的提取率。

1.3.3 單因素試驗

按照1.3.2中的方法進行單因素提取試驗，研究不同固液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時間分別對蝴蝶莢蒾花總黃酮得率的影響。

準(zhǔn)確稱取0.1 g蝴蝶莢蒾花粉5份，分別以1：10、1：15、1：20、1：25、1：30（g/mL）為固液比，加入 35%的乙醇，在50℃水浴中浸提30 min，測定固液比對蝴蝶莢蒾花總黃酮提取率的影響。

精確稱取0.1 g蝴蝶莢蒾花粉5份，分別以體積分數(shù)為30%、35%、40%、50%、60%的乙醇浸提劑，以1∶25（g/mL）的固液比，在50℃的水浴鍋中浸提30 min，測定乙醇濃度對蝴蝶莢蒾花總黃酮提取率的影響。

準(zhǔn)確稱取0.1 g蝴蝶莢蒾花粉5份，以1∶25（g/mL）的固液比，加入 35%的乙醇，分別在 40、50、60、70、80℃溫度下浸提30 min，測定不同溫度對蝴蝶莢蒾花總黃酮提取率的影響。

準(zhǔn)確稱取 0.1g蝴蝶莢蒾花粉 5份，以 1：25（g/mL）的固液比，加入 35%的乙醇，分別以 10、20、30、60、90min的時間，在50℃水浴鍋中浸提，以測定不同提取時間對蝴蝶莢蒾花總黃酮提取率的影響。

1.3.4 正交試驗

在參考資料和前期預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，考察固液比、乙醇濃度、提取時間以及提取溫度4個因素對提取率的影響，選取L9（34）正交設(shè)計[8-9]，得到最佳提取條件，以提高總黃酮的產(chǎn)量，試驗設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素水平設(shè)計Table 1 Factors and levels design of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.3.1的方法，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值和其濃度的關(guān)系見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Calibration curve of rutin

以吸光度值A(chǔ)對蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度C（mg/mL）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=11.505C+0.019 9，其中 R2為 0.998 8。

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 不同固液比對蝴蝶莢蒾花總黃酮固液比對黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 固液比對黃酮提取率的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate

如圖 2 所示，當(dāng)固液比在 1∶10（g/mL）到 1∶20（g/mL）之間時，黃酮提取率隨固液比的增大而增大，在固液比為1∶20（g/mL）時達到最大值，隨后，提取率隨固液比的增大反而減小。其原因可能是在一定的固液比范圍內(nèi)，蝴蝶莢蒾花細胞中的黃酮類物質(zhì)溶出隨固液比的增大而增大，在一定比例的固液比時，黃酮類化合物已基本溶出，此時再提高固液比不會促進黃酮類物質(zhì)的溶出，反而會增大雜質(zhì)的溶出從而影響提取結(jié)果，故選取固液比為 1∶20（g/mL）最合適。

2.2.2 不同乙醇濃度對蝴蝶莢蒾花總黃酮提取率的影響

不同乙醇濃度的浸提效果如圖3所示。

圖3 乙醇濃度對黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on extraction rate

在乙醇濃度達到30%到35%之間時，總黃酮提取率隨濃度增加而增加，在濃度為35%時，總黃酮提取率達到最大值，然而在此基礎(chǔ)上再增加乙醇濃度總黃酮提取率反而下降，尤其是酒精濃度從40%上升到50%時，總黃酮提取率下降特別明顯，從50%～60%下降速度變慢。可能是在一定乙醇濃度范圍內(nèi)，蝴蝶莢蒾花黃酮類色素隨乙醇濃度的增加溶出速度增加，到35%時溶出速度達到平衡。隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加，提取液中的一些葉綠素及其它色素和一些脂溶性物質(zhì)被提取出來，干擾因素也會隨之增加，從而影響黃酮類色素的溶出。因此，為了充分提取黃酮，故選擇35%的乙醇濃度較好。

2.2.3 不同提取溫度對蝴蝶莢蒾花總黃酮提取率的影響

提取結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取溫度對黃酮提取率的影響Fig.4 Effects of extracaug temperature on extraction rate

隨著溫度的上升，黃酮類化合物的提取率也隨之上升，原因是溫度上升可以促進分子運動，黃酮類化合物可以更容易從細胞質(zhì)中分離出來，溫度的升高可以促進提取率的升高，但在50℃后溫度的升高反而使得黃酮類化合物的提取率降低，可能是因為溫度過高時，一些黃酮類化合物遭到破壞，另外，溫度過高會導(dǎo)致提取液中雜質(zhì)含量增高，并且過高的溫度會使蝴蝶莢蒾花中的酚類物質(zhì)發(fā)生氧化褐變反應(yīng)，使產(chǎn)品顏色變深，影響產(chǎn)品質(zhì)量，因此選擇提取溫度為50℃。

2.2.4 不同提取時間蝴蝶莢蒾花總黃酮提取率的影響不同時間的浸提效果如圖5所示。

圖5 時間對黃酮提取率的影響Fig.5 Effects of extracang time on extraction rate

蝴蝶莢蒾花中總黃酮的提取率隨時間的延長先增加后下降至逐漸平緩，其提取率在30 min時達到最大，但如果提取時間過長，可能會使乙醇溶劑揮發(fā)，從而導(dǎo)致乙醇濃度下降，因此影響了黃酮類化合物的提取率。所以選擇提取的時間為30 min。

2.3 正交法對黃酮提取工藝的優(yōu)化

2.3.1 正交法回歸模型的建立與分析

正交試驗分析表見表2。

極差分析得到的平均提取率最高水平組合方案為 A3B3C3D1，即固液比 1∶25（g/mL）、乙醇濃度 40%、提取溫度60℃、時間10 min。根據(jù)正交試驗的結(jié)果可知，4種因素及其因素水平對提取率的影響是不同的。從C因素（溫度）來看，極差最大，說明溫度對提取率的影響最大；從B因素（乙醇濃度）來看，極差最小，說明選取的乙醇濃度對提取率的影響最小。各試驗因素之間存在一定的相互作用，對蝴蝶莢蒾花的提取率產(chǎn)生了不同的影響。根據(jù)極差R的大小得出對蝴蝶莢蒾花提取率的影響順序依次為C＞A＞D＞B，即提取溫度＞固液比＞提取時間＞乙醇濃度。

表2 正交試驗分析表Table 2 Results of orthogonal test

2.3.2 正交試驗結(jié)果方差分析

方差分析表見表3。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

按A3B3D3D1的條件進行驗證試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蝴蝶莢蒾花總黃酮提取率平均為9.23%，RSD為1.2%。

通過方差分析可以看出（表3），A、C因素對考察指標(biāo)有顯著性影響。B、D二因素對考察指標(biāo)無顯著性影響（P＞0.05）。

3 結(jié)論

通過正交試驗，確定4種因素對蝴蝶莢蒾花中黃酮類化合物提取率影響的大小順序為提取溫度＞固液比＞提取時間＞乙醇濃度。蝴蝶莢蒾花中黃酮類化合物提取最適條件為：固液比 1∶25（g/mL），乙醇濃度 40%，提取時間10 min，提取溫度60℃，總黃酮提取率平均為9.23%。本研究通過正交試驗優(yōu)選出最佳提取工藝條件，為有效提取蝴蝶莢花中黃酮類化合物提供了試驗依據(jù)。