付昊，龍虎，蔡自建，田詩佳，唐躍珊，丁心舒

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

天然抗氧化劑因在疾病預(yù)防與治療、延緩衰老過程中發(fā)揮重要作用而廣為人知，在這些天然抗氧化劑中，多糖通常被認(rèn)為是抗氧化性最強的一種。多糖是由單糖縮合的多聚物，廣泛分布在自然界中，是一種重要的活性物質(zhì)[1]。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到多糖與蛋白質(zhì)、核酸一樣，是涉及生命活動本質(zhì)的三類生物大分子之一[2]。熟地黃首載于《本草圖經(jīng)》，為玄參科植物地黃的塊根。近年研究結(jié)果表明，熟地黃多糖（Rehmannia glutinosa polysaccharide，RGP）具有提高機體抗氧化力、免疫力、抗焦慮、降血糖、促進(jìn)機體細(xì)胞有絲分裂、調(diào)整腸道免疫系統(tǒng)、抗病毒、抗腫瘤和作為免疫佐劑等作用[3-8]。對于熟地黃多糖的抗氧化作用研究已經(jīng)取得部分進(jìn)展，目前國內(nèi)外對熟地黃多糖的研究主要集中在其有利化學(xué)成分的提取技術(shù)和藥理作用，研究多為水提醇沉法、超聲波等提取法從地黃中提取到7種地黃多糖。此外，藥理作用已涉及到臨床研究應(yīng)用，包括可作為藥物作用理論基礎(chǔ)的機體造血、中樞抑制、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥等多種功能研究[9-11]，如苗明三等[10]以放血與磷并用致血虛模型大鼠為研究對象探討熟地黃多糖補血作用；黃霞等[11]用熟地黃多糖灌服小鼠，發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)小鼠血清溶血素的生成，提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)。這些研究說明熟地黃多糖具有提高小鼠免疫功能的作用。但對熟地黃多糖在生物體內(nèi)長時間作用的動態(tài)變化鮮見相關(guān)報道。因此，本研究針對熟地黃多糖對小鼠血清和肝臟抗氧化作用的動態(tài)變化作進(jìn)一步探索，為熟地黃多糖在食品中的實際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

天然熟地黃多糖：陜西森弗天然制品有限公司；昆明種健康小鼠（雌雄各半，120只），體重20 g左右：由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院提供，許可證號：SCXK（川）2018-19；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測試盒：南京建成生物工程研究所；BCA（bicinchoninic acid）法蛋白定量試劑盒：北京天恩澤生物技術(shù)有限公司。

UV-1000型紫外可見分光光度計：翱藝儀器（上海）有限公司；TGL-16臺式高速冷凍離心機：長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；BT25S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 劑量設(shè)計

動物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境：溫度（23±1）℃，相對濕度（60±5）%，明暗周期12 h，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)。小鼠于實驗環(huán)境條件下適應(yīng)3 d后，隨機分為4組，每組30只，分別為實驗組（低、中、高劑量組）和對照組。實驗組連續(xù)每天灌胃給予150、300、550 mg/kg熟地黃多糖，對照組給予等量蒸餾水。小鼠灌胃體積為0.1mL/10 g，灌胃期間自由攝食和飲水。所用實驗條件和方法均按照參考文獻(xiàn)[12]中抗氧化作用檢測方法進(jìn)行。

1.2.2 小鼠血清和肝臟中SOD、MDA及GSH-Px測定[13-14]

小鼠采血前禁食12h后，所有小鼠稱重，灌胃30min后眼眶采血0.5 mL后離心取血清，血樣于4 000 r/min離心15 min，分離出血清，-20℃保存?zhèn)溆?。隨后，小鼠進(jìn)行頸椎脫臼處死，取其肝臟并稱重。在0.9%的預(yù)處理冰冷的生理鹽水溶液中漂洗，除去殘留血液，濾紙拭干。取肝臟組織塊500 mg，加入9倍預(yù)冷的0.9%生理鹽水溶液[料液比為1∶9（g/L）]，在研缽中制成10%的組織勻漿，-20℃保存?zhèn)溆?。組織勻漿以3 000 r/min離心15 min，收集上清液。測定指標(biāo)的所有操作均按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 熟地黃多糖對小鼠體重的影響

在給予小鼠受試物7、14、21、28 d時，分別測定實驗組和對照組小鼠的體重，結(jié)果詳見圖1。

圖1 服用不同劑量的RGP對小鼠體重的動態(tài)影響Fig.1 The effect of different doses RGP on the mice body weight

從圖1可以看出，各組小鼠之間的體重沒有顯著性差異。說明連續(xù)服用不同劑量的熟地黃多糖不會對小鼠體重產(chǎn)生影響。

2.2 RGP抗氧化的測定結(jié)果

2.2.1 RGP對肝臟和血清中SOD活性的影響

SOD是人體細(xì)胞代謝極其重要的一種活性蛋白酶，它能有效催化清除超陰離子自由基的反應(yīng)。通過檢測肝臟和血清中SOD的活性來觀察劑量效應(yīng)，實驗結(jié)果見圖2。

圖2 RGP對小鼠肝臟和小鼠血清中SOD活性的影響Fig.2 The effect of RGP on SOD in the liver and serum of mice

如圖2所示，低、中、高劑量組的肝臟（圖2A）和血清（圖2B）中SOD活性均高于對照組（P＜0.05）。連續(xù)服用14 d時，中劑量組較顯著（P＜0.001）；連續(xù)服用21 d時，中劑量組顯著高于低劑量組（P＜0.05），極顯著高于高劑量組（P＜0.001）；連續(xù)服用28 d時，各劑量組間無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)果表明服用各劑量熟地黃多糖均具有顯著增加SOD含量的作用，其中，中劑量影響更顯著（P＜0.01）。在同一劑量水平觀察時間效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)各劑量組SOD活性隨時間的增加也呈現(xiàn)出動態(tài)增加（P＜0.05）。對于低劑量組SOD含量，21、28 d均極顯著高于 14 d（P＜0.001），28 d與 21 d無明顯差異（P＞0.05）。各劑量組在連續(xù)服用14 d時有增加SOD含量作用，隨著時間的延長，SOD含量均呈現(xiàn)先上升后趨于平緩的趨勢；對比肝臟和血清，RGP對肝臟中SOD活性增強效果優(yōu)于血清中。

2.2.2 RGP對肝臟和血清中GSH-Px的影響

GSH-Px是機體內(nèi)廣泛存在的過氧化酶分解酶，可以清除自由基和抑制自由基的反應(yīng)，減少對生物體的損害，測試GSH-Px含量的變化可體現(xiàn)RGP的抗氧化強度，實驗結(jié)果見圖3。

圖3RGP對小鼠肝臟和小鼠血清中GSH-Px的影響Fig.3 The effect of RGP on GSH-Px in the liver and serum of mice

如圖3所示，通過劑量效應(yīng)觀察發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量組肝臟、血清中GSH-Px含量均顯著高于對照組（P＜0.05）；中、高劑量組顯著高于低劑量組（P＜0.01，P＜0.05），中、高組間無明顯差異（P＞0.05）。表明服用各劑量熟地黃多糖均具有顯著增加GSH-Px含量的作用，其中，中、高劑量組的RGP影響更顯著（P＜0.01）。對比肝臟和血清，RGP對血清中的GSH-Px的增加能力更明顯。在同一劑量水平，通過時間效應(yīng)觀察發(fā)現(xiàn)，各劑量組GSH-Px含量隨時間增加均明顯增加（P＜0.05）。對于低劑量組GSH-Px含量，14 d時與空白組無顯著差異（P＞0.05），21 d 明顯高于 14 d（P＜0.05），28 d 與21 d無顯著差異（P＞0.05）；對于中劑量組GSH-Px含量，14 d時極顯著高于空白組（P＜0.001），21 d時明顯高于14 d（P＜0.05），28 d時與21d時無顯著差異（P＞0.05）；對于高劑量組GSH-Px含量，14 d極顯著高于空白組（P＜0.001），21 d 極顯著高于 14 d（P＜0.001），28 d極顯著高于21 d（P＜0.01）。隨著時間的延長，服用低、中劑量的RGP時，GSH-Px先上升后趨于平緩；服用高劑量的RGP時，GSH-Px上升趨勢顯著高于低、中劑量組。

2.2.3 RGP對肝臟、血清中MDA的影響

MDA在體內(nèi)自然生成，是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物，其含量能夠判斷脂質(zhì)過氧化的程度，從而反映細(xì)胞受損傷的程度，實驗結(jié)果見圖4。

圖4RGP對小鼠肝臟和小鼠血清中MDA的影響Fig.4 The effect of RGP on MDA in the liver and serum of mice

如圖4所示，通過劑量效應(yīng)觀察發(fā)現(xiàn)，低、中、高劑量組肝臟和血清中MDA含量均低于對照組，但在14、21 d時，低劑量組與空白組間無明顯差異（P＞0.05），14 d時，中、高劑量組極顯著低于空白組（P＜0.001），21 d時，中、高劑量組顯著低于空白組（P＜0.01，P＜0.05）；在28 d時，低、中、高劑量組均極顯著于空白組（P＜0.01）。中、高劑量RGP均具有顯著減少MDA含量的作用，中劑量效果最佳；對比肝臟和血清，RGP對血清中的MDA的降低能力更明顯。在同一劑量水平時間效應(yīng)觀察發(fā)現(xiàn)，各劑量組MDA含量隨時間延長均呈現(xiàn)降低趨勢（P＜0.05）。

3 結(jié)論

衰老自由基學(xué)說是現(xiàn)代衰老理論中具有代表性學(xué)說之一，該學(xué)說認(rèn)為自由基的增多是導(dǎo)致機體衰老的重要因素，自由基可使生物膜中的多種不飽和脂類發(fā)生超氧化，形成脂質(zhì)過氧化物，從而引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能破壞[2]。氧化損傷不僅與多種疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系，還可誘導(dǎo)機體細(xì)胞的壞死與凋亡，是人類衰老的重要原因之一[15-16]。生物體內(nèi)存在一套完整的抗氧化系統(tǒng)，在正常生理條件下，自由基不斷生成，又不斷地被清除，從而維持相對的動態(tài)平衡[17-18]。因此，選用SOD、GSH-Px活力及MDA含量水平來作為衡量機體抗氧化能力的指標(biāo)[19-20]。

研究表明，小鼠服用低、中、高劑量的熟地黃多糖，均能夠起到提高機體的SOD和GSH-Px活力，并能有效降低MDA含量，表明熟地黃多糖具有抗氧化作用，這與苗明三等的結(jié)果一致[4]。熟地黃多糖隨著時間和劑量的增加，在一定范圍內(nèi)對機體的抗氧化作用也不斷增強，說明熟地黃多糖可通過提高機體內(nèi)抗氧化酶的活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)以增強抗氧化功能。熟地黃多糖由于添加水平的不同和時間的差異，導(dǎo)致肝臟和血清中的SOD和GSH-Px活性及MDA含量之間的變化趨勢略有差異，這可能是由于機體存在不同的抗氧化調(diào)節(jié)機制引起的，其他研究也表明SOD和GSH-Px在某種狀況下并非同時增加，而是一種機制激活時，另一種可能處于抑制狀態(tài)，在一定范圍內(nèi)呈動態(tài)變化，這與黎瑞珍等的研究一致[21]。另一方面，生物氧化反應(yīng)涉及多種酶，多糖一方面能夠抑制脂肪氧化酶，另一方面也可通過抑制與氧化相關(guān)的酶而在生物體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用[22-23]。楊兵等[24]研究表明熟地黃多糖對斷奶仔豬血清乳酸脫氫酶活性有一定降低作用。而血清乳酸和乳酸脫氫酶是糖代謝中的重要物質(zhì)之一。由此推測熟地黃多糖可能存在多種抗氧化機理，具體的調(diào)節(jié)機理還有待進(jìn)一步研究和探討。

綜上，熟地黃多糖可以提高機體內(nèi)抗氧化相關(guān)酶的活性，抑制自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的不良代謝產(chǎn)物，起到較好的抗氧化作用，可在后續(xù)研究中分離提取找到活性單體成分，為在食品中的實際開發(fā)和利用提供參考。