魏敏，宋旭艷，陳義坤，潘曦，羅誠浩

（湖北中煙工業(yè)有限責任公司，湖北武漢430040）

靈香草（Lysimachia foenum-graecum Hance）又名香草、佩蘭和排草等，為報春花科（Primulaceae）排草屬（Lysimachia L.）植物，主產(chǎn)于廣西、云南等地[1]。以靈香草為原料提取得到的萃取物及其精油，香氣持久、穩(wěn)定，可用于制作煙草及香脂等[2-3]。靈香草富含多種活性物質(zhì)，如黃酮類、三萜類、多酚類和多糖類等[4]。目前關(guān)于靈香草精油和浸膏提取、分析及應(yīng)用的研究報道較多[2-6]，多采取水蒸氣蒸餾、溶劑萃取等方法制備。而β-葡萄糖苷酶能夠水解果蔬中本身不具有香味且不易揮發(fā)的風味物質(zhì)，對果蔬風味增香及食品加工過程中香氣物質(zhì)的釋放起重要作用[7-8]。近年來采用β-葡萄糖苷酶改善香料、果汁等食品風味的報道較多[9-11]，但鮮見其水解輔助提取靈香草揮發(fā)油的相關(guān)報道。本試驗對比研究β-葡萄糖苷酶輔助提取的靈香草油及其未酶水解對照組的揮發(fā)性化學(xué)成分，為酶技術(shù)在香料植物提取中的應(yīng)用和香料植物資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈香草（干全草）：產(chǎn)地廣西桂林；β-葡萄糖苷酶（食品級，酶活100 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；二氯甲烷（色譜純）：Fisher Chemical公司；乙酸、丙酸苯乙酯（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。取0.18 g丙酸苯乙酯（內(nèi)標）置于100 mL容量瓶中，加入二氯甲烷定容至刻度，混勻，用于氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析。

1.2 儀器與設(shè)備

電子調(diào)溫電熱套（98-1-B型）、粉碎機（FW177型）：天津市泰斯特儀器有限公司；天平（CP3235-OCE、BP221S）：德國Sartorius公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 6890N/5973型）：安捷倫科技公司。酸，調(diào)節(jié)至pH 5，在45℃條件下平衡0.5 h，加入占靈香草粉質(zhì)量分數(shù)0.15%的β-葡萄糖苷酶攪拌均勻，45℃溫育18 h；采用水蒸氣蒸餾法[5]，用調(diào)溫電熱套加熱直至沸騰，調(diào)節(jié)電熱套電壓，使其保持微沸狀態(tài)蒸餾6 h，含有精油的水蒸氣經(jīng)由導(dǎo)管收集冷卻餾出后，經(jīng)過無水硫酸鈉脫水處理，得到β-葡萄糖苷酶輔助提取靈香草揮發(fā)油-處理組。

1.3.2 靈香草油對照組的制備

將靈香草干草放入粉碎機中粉碎至細粉，過40目篩得到靈香草粗粉，將200 g靈香草粗粉和2.0 L水依次裝入5 L圓底燒瓶中混合攪拌均勻，加入1.6 g乙酸，調(diào)節(jié)至pH 5，在45℃條件下平衡0.5 h，45℃溫育18 h。采用水蒸氣蒸餾法，微沸蒸餾6 h，收集冷卻餾出的精油，經(jīng)過無水硫酸鈉脫水處理，得到靈香草揮發(fā)油-對照組。

1.3.3 揮發(fā)性成分GC-MS對比分析

1.3.3.1 含內(nèi)標的揮發(fā)油樣品的配置

將揮發(fā)油處理組和對照組分別用二氯甲烷稀釋100倍，取1 mL置于色譜瓶中；取10 μL 1.1所述的內(nèi)標溶液加入上述色譜瓶中，混勻。

1.3.3.2 GC-MS分析

HP-5 MS（50 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細管柱；進樣溫度：250℃；分流比 50 ∶1；載氣：He，1 mL/min；升溫程序：從 50℃（1 min）以5℃/min升到250℃（5 min）；傳輸線溫度：250℃；離子源：EI源；電子能量：70 eV；掃描范圍：50 amu～550 amu；使用WILEY和MINILAB譜庫進行檢索定性，內(nèi)標法定量，用峰面積歸一化法測定了各化學(xué)成分的相對質(zhì)量分數(shù)。

1.3 方法

1.3.1 β-葡萄糖苷酶水解增香制備靈香草揮發(fā)油

將靈香草干草放入粉碎機中粉碎至細粉，過40目篩得到靈香草粗粉；將200 g靈香草粗粉和2.0 L水依次裝入5 L圓底燒瓶中混合攪拌均勻，加入1.6 g乙

2 結(jié)果與分析

經(jīng)β-葡萄糖苷酶輔助提取的靈香草揮發(fā)油及其對照組的揮發(fā)性成分GC/MS檢測分析結(jié)果見表1。

從表1可以看出，對照組靈香草揮發(fā)油中共分離鑒定出43種揮發(fā)性物質(zhì)，包括酸類4種（33.08%），醇類 8種（17.22%），醛類 3種（15.72%），烯類 6種（4.86%），酯類5種（1.88%），酮類2種（1.47%），芳香烴類7種（4.10%），烷烴1種（0.14%）和其他雜環(huán)類化合物7種；經(jīng)β-葡萄糖苷酶輔助提取的處理組靈香草揮發(fā)油中共分離鑒定出63種揮發(fā)性香氣成分，總相對百分含量為78.33%，包括酸類8種（28.94%），醇類8種（15.41%），芳香烴類 13種（9.14%），醛類 4種（8.96%），酯類 5種（5.44%），酮類 6種（2.80%），烷烴類 5種（2.22%），烯類 5種（1.08%），酚類 1種（0.16%）和8種其他雜環(huán)化合物。

表1 β-葡萄糖苷酶輔助提取的靈香草揮發(fā)油及其對照的揮發(fā)性成分GC/MS對比分析Table 1 Comparative analysis of volatile components in GC/MS between the oil of Lysimachia foenum-graecum Hance drolyzed by β-glucosidase and its control group

續(xù)表1 β-葡萄糖苷酶輔助提取的靈香草揮發(fā)油及其對照的揮發(fā)性成分GC/MS對比分析Continue table 1 Comparative analysis of volatile components in GC/MS between the oil of Lysimachia foenum-graecum Hance drolyzed by β-glucosidase and its control group

續(xù)表1 β-葡萄糖苷酶輔助提取的靈香草揮發(fā)油及其對照的揮發(fā)性成分GC/MS對比分析Continue table 1 Comparative analysis of volatile components in GC/MS between the oil of Lysimachia foenum-graecum Hance drolyzed by β-glucosidase and its control group

處理組新增39種揮發(fā)性物質(zhì)，主要有右旋龍腦、十一烯醛、大馬士酮、β-紫羅蘭酮、肉豆蔻醛、（+）-白菖油萜、月桂酸、4-甲基二苯并呋喃、2-羥基-4，6-二甲氧基苯甲醛、十三酸、芴、9-芴醇、9-芴酮、呋喃、菲、金合歡基丙酮、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯等。其中，右旋龍腦又稱冰片，有清香氣和涼味，使喉部刺激感降低；十一烯醛，稀釋后有強烈的玫瑰、柑橘型香氣；月桂酸是高級脂肪酸，存在于烤煙煙葉、煙氣中，天然存在于月桂油中；大馬士酮是萜烯類香氣物質(zhì)，有甜水果香氣；β-紫羅蘭酮香氣較柔和而木香稍重，具有覆盆子的香味，被稀釋以后有類似紫羅蘭花和柏木香味；肉豆蔻醛具有脂肪香、蠟香、牛奶香、奶油香、魚香、果香等，這些酮類物質(zhì)具有明顯的致香作用，能夠賦予煙氣木香、花香、果香、成熟煙草香特征[12]；脂肪酸酯類具有甜味、水果香味或酒香味，與煙香尤其是烤煙香氣協(xié)調(diào)，能使煙氣變得醇和[13]；相對百分含量增加揮發(fā)性物質(zhì)有8種，包括芳樟醇、α-萜品醇、茴香腦、棕櫚酸等成分，其中芳樟醇屬于鏈狀萜烯醇類，具有鈴蘭香氣，α-萜品醇具有優(yōu)雅穩(wěn)定持久的紫丁香香氣，稀釋后有桃似的甜味，茴香腦帶有甜味，具茴香的特殊香氣，棕櫚酸具有特殊香氣等；相比對照組，處理組中31種揮發(fā)性物質(zhì)消失或相對百分含量降低，如十四烯醛、薄荷醇、十一醛、環(huán)庚烯、5-氨基-1-苯基吡唑、β-石竹烯、亞油酸、（+）-花側(cè)柏烯、二苯并呋喃、十三醛、芴、氧化石竹烯等。總之，經(jīng)酶水解輔助提取的靈香草揮發(fā)油的揮發(fā)性物質(zhì)相比對照組變化較大，可能是經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解斷裂糖苷鍵，轉(zhuǎn)化了一些非揮發(fā)性物質(zhì)為揮發(fā)性香氣成分。

3 結(jié)論

本試驗采用β-葡萄糖苷酶輔助提取靈香草揮發(fā)油，并采取GC-MS技術(shù)檢測分析其與對照組的揮發(fā)性物質(zhì)，分離鑒定出63種揮發(fā)性物質(zhì)，比對照組的41種增加了53.66%，其中新增加揮發(fā)性物質(zhì)有39種，包括了右旋龍腦、十一烯醛、大馬士酮、β-紫羅蘭酮、肉豆蔻醛等多種香氣成分，揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)生了較大改變，為β-葡萄糖苷酶水解輔助提取在香料植物提取中的應(yīng)用和靈香草資源開發(fā)利用提供參考和指導(dǎo)。