侯惠靜，吳子健，石振鵬，姜宇峰

（1.天津天獅學院生物與食品工程學院，天津301700；2.天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

雞卵類黏蛋白（hen-egg ovomucoid，HOVM）是一種雞蛋卵清蛋白（分子量為28 kDa），是典型的Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑，具有3個相互對立的同源Kazal結構域，每個結構域約含有60個氨基酸殘基以及3個域內二硫鍵[1]，可有效抑制胰蛋白酶的活力，其抑制β-牛胰蛋白酶的主要活性位點位于第二結構域上，HOVM是單頭胰蛋白酶抑制劑（single-headed trypsin inhibitor），1分子HOVM只能抑制1分子的胰蛋白酶[2-3]。

HOVM分子不僅含有蛋白部分，還含有約20%～25%的糖基部分[4]，有3類五觸角雜合型的N-連接寡糖基團參與了糖基的構成，這些寡糖基團以含3個甘露糖的五糖殘基（Manα1→6（Manα1→3）Manβ1→4GlcNAcβ1→4GlcNAc）為核心，單糖殘基主要包括N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖、半乳糖以及唾液酸等；寡糖基團與蛋白部分的鏈接位點位置都具有Asn-XThr/Ser 序列[5]，分別位于 Asn10、Asn53、Asn69、Asn75以及Asn175[4]。

HOVM可用于純化胰蛋白酶的親和柱的配基，但如何調整利用其與胰蛋白酶之間的結合對于親和柱的開發(fā)制備具有很重要的意義，同時HOVM上糖基含量與其抑制胰蛋白酶活性之間的關系對于研究HOVM的胰蛋白酶抑制作用也有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料

胰蛋白酶250 U/mg、N-苯甲?；?L-精氨酸乙酯鹽酸鹽（Nα-Benzoyl-L-arginine ethyl ester hydrochloride BAEE）、8-苯氨基-1-萘磺酸（8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、β-甘露糖苷酶：Sigma公司。

1.1.2 儀器

3-18k離心機：德國Sigma公司；FDU-810型EYELA冷凍干燥機：日本東京理化公司；UV-2700紫外可見分光光度計：日本島津公司；Nicolet5700傅里葉紅外光譜儀：美國尼高力儀器公司；MOS-450/AF-CD圓二色譜儀：法國Biologic公司。

1.2 方法

1.2.1 雞卵類黏蛋白的制備工藝

HOVM的分離與純化按照吳子健等的方法[6]進行，具體方法為：手工分離得到的雞蛋清與去離子水按體積比1∶1混合降低黏度，然后加入2倍體積的10%三氯乙酸溶液混合均勻后，用1.0 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH值至3.5，0～4℃下靜置過夜，離心后所得上清于4℃下透析過夜除去三氯乙酸，然后再進行硫酸銨（硫酸銨飽和度為50%）鹽析，所得的上清中的硫酸銨飽和度再調至80%，靜置24 h，離心，得到的沉淀透析除鹽后凍干，就得到了HOVM樣品。

1.2.2 β-甘露糖苷酶酶切處理HOVM[7-9]

HOVM蛋白用β-甘露糖糖苷酶進行酶解處理，具體方法如下：20 mg/mL HOVM蛋白溶液（100 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH5.5），分別按比例加入3.75 U/100 mg、7.50 U/100 mg、15.00 U/100 mg 的 β-甘露糖苷酶于37℃下反應，空白組為不加β-甘露糖苷酶的20 mg/mL HOVM溶液。酶解后立即用冰浴冷卻至4℃，然后加入無水硫酸銨至飽和度為40%，4℃下靜置6 h后，離心（4℃，4 000×g）15 min后取上清；上清液中繼續(xù)添加無水硫酸銨至飽和度為80%，4℃下靜置6 h后，離心（4℃，4 000×g）15 min取沉淀得到經糖苷酶酶解的HOVM蛋白，再經透析除硫酸銨后進行真空冷凍干燥。

1.2.3 總糖的測定

總糖的測定按照苯酚-硫酸法測定。

1.2.4 圓二色譜法

按照Yamamoto等[10]的方法進行圓二色譜（circular dichroism，CD）檢測及分析，具體操作步驟為：0.2 mg/mL蛋白樣品溶液（10 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4）。圓二色譜的參數為：光徑為1.0 cm、掃描波長范圍190 nm～250 nm、帶寬1.0 nm、掃描速率60 nm/min。蛋白二級結構含量利用DichroWeb程序（http：//dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml）在線分析。

1.2.5 蛋白表面疏水性的測定

蛋白表面疏水性的測定按照Ruan等[11]的方法，以ANS作為外源性熒光探針，2 mL 500 μg/mL HOVM樣品液（10 mmol/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液，pH7.4）加入10 μL ANS溶液（5.0 mmol/L），于20℃下避光孵育1.0 h，然后掃描測定發(fā)射波長在400 nm～700 nn范圍內蛋白樣品的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長設為380 nm，狹縫校正寬度為5 nm，掃描速率為1 200 nm/min。

1.2.6 胰蛋白酶抑制率的測定[12]

胰蛋白酶活性測定加樣見表1。

表1胰蛋白酶活性測定加樣表Table 1 Sample application table for trypsinase activity determination

按照表1所示加樣并檢測，每隔30 s讀A253nm的數值并記錄，計時5 min，計算胰蛋白酶活性。

一個胰蛋白酶活力單位定義為：以BAEE為底物，pH 7.6，溫度25℃，反應體積3.2 mL胰蛋白酶酶解BAEE每分鐘產生0.001單位的A253nm變化。

式中：A0為反應初測得的光吸收變化值；A1為反應5 min后測得的光吸收變化值；A2為不加HOVM時得到的光吸收變化值；A3為加HOVM時得到的光吸收變化值。

1.2.7 試驗數據統(tǒng)計與分析

3次重復試驗，數據采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行相關處理以及顯著性分析，結果均以平均值±標準差來表示，利用軟件origin8.8進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 β-甘露糖苷酶酶解對HOVM中糖基含量的影響HOVM經過β-甘露糖苷酶酶切處理后，HOVM

蛋白中所含糖基的含量變化如圖1所示。

圖1 β-甘露糖苷酶酶切處理對HOVM中糖基含量的影響Fig.1 Effects of enzymolysis by β-mannosidase on contents of sugar group in HOVM

通常雞卵清中的HOVM蛋白約含20%～25%的糖基，其中第三個結構域中的Asn175若未糖基化，則HOVM中的糖基含量為20%，而本研究中的對照組（Control組）的糖基含量為20%，可能是由于其一級結構中的Asn175未被糖基化。圖1的結果表明：酶解時間延長和酶活力單位添加的增大是有利于糖苷酶酶切HOVM中糖基的效果；HOVM所含糖基中甘露糖殘基約占6.50%～8.50%，當用β-甘露糖苷酶酶解處理HOVM，當兩者按15.00 U/100 mg混合時，酶解48 h后，HOVM上的糖基含量趨于穩(wěn)定，此時HOVM上剩余糖基含量約為11.18%。

2.2 β-甘露糖苷酶酶解對HOVM表面疏水性的影響

通常水溶性蛋白表面的氨基酸殘基為親水性氨基酸殘基，而帶有疏水側鏈的氨基酸殘基常處于分子核心內部。表面疏水性是蛋白質的重要特性之一，通過檢測蛋白質表面疏水性的變化可以監(jiān)控蛋白質構象的變化[13]。酶底比為15Uβ-甘露糖苷酶/100 mg HOVM條件下，β-甘露糖苷酶酶解HOVM后，利用疏水探針ANS，激發(fā)波長380 nm，測定發(fā)射波長400 nm～700 nn范圍熒光發(fā)射光譜，其結果如圖2所示。

圖2 β-甘露糖苷酶酶解對HOVM蛋白表面疏水性的影響Fig.2 Effects of enzymolysis by β-mannosidase on surface hydrophobicity of HOVM

相對與未進行酶處理的HOVM來說，β-甘露糖苷酶酶解后的HOVM的最大發(fā)射波長幾乎沒有出現紅移或藍移，但熒光強度增大了，表明β-甘露糖苷酶酶解提高了HOVM蛋白表明疏水性，可能的原因在于：其一、HOVM中的糖基含量較高，而且每個糖基化位點上的寡糖鏈為雜合型的N-鏈接糖鏈，五糖核心又延伸出5個支鏈，這些寡糖鏈多處于HOVM空間結果的表面，會在空間上掩蔽蛋白中一部分疏水性氨基酸殘基，但當這些寡糖鏈上的糖殘基被酶切下來脫離了蛋白部分，那么原本被掩蔽的疏水性部分就會被暴露出來，從而使得被酶切去部分糖基的HOVM與疏水性ANS熒光探針的結合能力提高；其二、寡糖基團含有親水性的羥基，當糖殘基從蛋白質上脫離開來，勢必也會使親水性減弱。

2.3 β-甘露糖苷酶酶解對HOVM胰蛋白酶抑制率的影響

酶底比為15Uβ-甘露糖苷酶/100 mgHOVM，酶解處理時間（12、24、36、48、60 h），HOVM 上糖基含量與酶解后HOVM對胰蛋白酶酶活力抑制率之間的關系如圖3所示。

圖3 β-甘露糖苷酶酶解對HOVM胰蛋白酶抑制率的影響Fig.3 Effects of enzymolysis by β-mannosidase on HOVM trypsin inhibition rate

隨著β-甘露糖苷酶酶解時間的延長，HOVM蛋白上的糖基含量是下降的，而HOVM對胰蛋白酶抑制率呈現上升趨勢，當酶解36 h后，HOVM胰蛋白酶抑制率達到90.4%，基本達到最高程度，48 h以及60 h，HOVM胰蛋白酶抑制率基本不再變化，也就是HOVM上寡糖基團含量的減少會提高其對胰蛋白酶的抑制率。其可能的原因在于：HOVM是典型的Kazal型蛋白酶抑制劑，HOVM的第二個結構域是直接與胰蛋白酶接觸作用，該結構域上的Arg89的側鏈會深入到胰蛋白S1腔內，除此之外，包括這個Arg89總共有12個與蛋白酶接觸的氨基酸殘基[14]，寡糖糖基會影響這些位點與蛋白酶的接觸作用，但當這些寡糖基團被水解處理下來后，其空間位阻會減少，也就是第二結構域與胰蛋白酶接觸的可能性會增大，其抑制酶活力的效果會提高。

2.4 β-甘露糖苷酶酶解對HOVM二級結構的影響

β-甘露糖苷酶處理后的HOVM按照濃度0.5mg/mL溶于磷酸鹽緩沖液中，其圓二色譜圖及其二級結構組成分析如圖4所示。

在溶液狀態(tài)下，HOVM各二級結構相對含量的變化范圍較紅外表征的結果?。害?螺旋為34.4%～35.2%、β-折疊為 10.6%～11.1%、β-轉角為 22.7%～23.3%、無規(guī)則卷曲為30.9%～32.5%。通過CD的表征表明：糖苷酶酶切處理對HOVM規(guī)正的二級結構（α-螺旋和β-折疊）以及β-轉角的組成的影響較小，可能的原因在于HOVM的蛋白質部分含3個相對獨立的結構域，且每個結構域均3個二硫鍵，極大地限制了構象變化以及維系著其天然構象的穩(wěn)定性，這一點與2013年Sara Benedé等[15]的CD表征結果相一致。但是不同的是，β-甘露糖苷酶處理會降低其二級結構組成中無規(guī)則卷曲的組成，無規(guī)則卷曲的組成由32.5%降低到了30.9%。

圖4 β-甘露糖苷酶酶解后HOVM二級結構組成的CD光譜分析Fig.4 Secondary structure composition analysis of post-βmannosidase-digestion HOVM by circular dichroism

2.5 β-甘露糖苷酶酶解對HOVM各個二級結構組成的影響

酶底比為5.0Uβ-甘露糖苷酶/100 mg HOVM底物條件下，經過酶解處理后，HOVM蛋白上的各個二級結構組成與其胰蛋白酶抑制活性之間的變化關系如圖5所示，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行了顯著性分析，如表1所示。

結果表明：經β-甘露糖苷酶酶解處理，HOVM對胰蛋白酶抑制活性的變化與該蛋白中無規(guī)則卷曲含量的變化呈顯著相關性（p＜0.01），而與其它二級結構組成含量的變化無相關性；在12 h～60 h時間范圍內，隨酶解時間延長，HOVM對胰蛋白酶抑制率會提高，而無規(guī)則卷曲的含量下降。其可能的原因在于：β-甘露糖苷酶酶解處理降低了HOVM分子寡糖基團含量，一方面會使HOVM分子中原本受寡糖基團空間掩蔽的含疏水性基團的氨基酸殘基被暴露出來，而這些失去掩蔽的疏水性基團是無法長時間暴露在蛋白質親水性表面的，它們彼此之間會發(fā)生疏水相互作用，進而HOVM局部結構做微小調節(jié)；另一方面，原本的無規(guī)則卷曲主要是由含有親水性基團的氨基酸殘基組成，分布于水溶性蛋白質的表面，而蛋白質中的寡糖基團中的羥基會與無規(guī)則卷曲中氨基酸殘基側鏈的親水性基團形成氫鍵，而寡糖基團被酶解去除后，原有的氫鍵消除，而新的氫鍵會形成，蛋白質的結構也會發(fā)生改變，原本某些無規(guī)則卷曲的部分可能會變成規(guī)正或部分規(guī)正的二級結構。但更深層次的原因還需要進一步探討。

圖5 β-甘露糖苷酶處理后HOVM各二級結構組成與胰蛋白酶抑制率Fig.5 Variation of HOVM’s secondary structure component and trypsin inhibition rate after β-mannosidase treatment

表2 β-甘露糖苷酶處理后HOVM二級結構組成與其胰蛋白酶抑制率之間的相關性分析Table 2 Analysis of the correlation between secondary structure component variation of HOVM and trypsin inhibitory rate following β-mannosidase treatment

3 結論

經β-甘露糖苷酶酶解處理，隨著酶解時間（12、24、36、48、60 h）的延長，HOVM上寡糖基團含量由20%降低至11.8%并且不再降低；隨著寡糖基團含量的降低，HOVM蛋白的疏水性提高；蛋白中無規(guī)則卷曲的含量由32.5%降低至30.9%，同時胰蛋白酶的抑制率由84.9%逐漸增高至90.1%，且兩者之間的變化具有極其顯著的相關性。